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摘要目的:<br>　　本项目主要探讨ciRS-7竞争性吸附miR-432-5p调控DNMT3B,进而调节TGM3甲基化的水平参与喉鳞状细胞癌生物学改变的调控机制，为喉鳞状细胞癌的临床诊断和治疗提供新的靶点。<br>　　第一部分 ciRS-7在喉鳞状细胞癌中高表达并发挥致癌作用<br>　　方法:<br>　　（1）收集临床喉鳞状细胞癌组织及癌旁组织，RT-qPCR分别检测ciRS-7在两者中的表达水平。<br>　　（2）利用RT-qPCR检测正常呼吸道上皮细胞NRECs、人喉鳞状细胞癌细胞系 FD-LSC-1、UM-SCC-10A、HN-4 中 ciRS-7 的表达水平。<br>　　（3）分析ciRS-7与喉鳞癌患者临床病理特征的关系。<br>　　（4）分别在UM-SCC-10A和HN-4中沉默ciRS-7的表达，通过RT-qPCR检测si-ciRS-7的干扰效果。利用流式细胞术、CCK-8、Transwell细胞侵袭与迁移试验、Western blot检测沉默ciRS-7后对喉鳞状细胞癌增殖、凋亡、侵袭与迁移及上皮间质转化的影响。<br>　　结果:<br>　　（1）RT-qPCR结果显示相对于癌旁组织和正常呼吸道上皮细胞，ciRS-7在喉鳞状细胞癌组织及各喉鳞状细胞癌细胞系中均高表达（P＜0.05）。<br>　　（2）ciRS-7的表达在不同年龄及性别的喉鳞状细胞癌患者间差异无统计学意义（P＞0.05）;而在不同TNM分期、临床浸润程度及是否存在淋巴结转移间差异有统计学意义（P＜0.05）。<br>　　（3）沉默ciRS-7的表达可抑制喉鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮间质转化并促进癌细胞凋亡（P＜0.05）。<br>　　小结:<br>　　ciRS-7在喉鳞状细胞癌病理组织和各喉鳞状细胞癌细胞系中高表达，并且在有淋巴结转移及高分期患者中ciRS-7的表达量更高。沉默喉鳞状细胞癌细胞中ciRS-7的表达可抑制喉鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭及上皮间质转化，促进喉鳞状细胞癌细胞凋亡。<br>　　第二部分 ciRS-7通过竞争性结合miR-432-5p调控DNMT3B的表达发挥致癌作用<br>　　方法:<br>　　(1)通过TCGA数据分析miR-432-5p在头颈鳞癌中的表达水平，通过生物信息学网站 StarBase 预测 ciRS-7 和 miR-432-5p 以及 miR-432-5p 和 DNMT3B的相互靶向关系。<br>　　(2)通过双荧光素酶报告基因实验检测ciRS-7和miR-432-5p以及miR-432-5p和DNMT3B之间的相互作用，通过RIP实验检测ciRS-7、miR-432-5p和DNMT3B与Ago2的结合情况。<br>　　(3)利用RT-qPCR检测喉鳞状细胞癌组织中miR-432-5p和DNMT3B的表达，并分析ciRS-7、miR-432-5p和DNMT3B在肿瘤组织中表达的相关性。<br>　　(4)在喉鳞状细胞癌细胞系UM-SCC-10A和HN-4中过表达miR-432-5p,通过流式细胞术、CCK-8、Transwell细胞侵袭与迁移实验、Western blot检测过表达miR-432-5p对喉鳞状细胞癌增殖、凋亡、侵袭与迁移及上皮间质转化的影响。<br>　　(5)在 UM-SCC-10A 和 HN-4 细胞中沉默 ciRS-7,RT-qPCR 和 Western blot 检测 miR-432-5p 和 DNMT3B 的表达。<br>　　(6)在喉鳞状细胞癌细胞系UM-SCC-10A和HN-4中沉默ciRS-7或同时沉默ciRS-7和miR-432-5p,以及沉默ciRS-7的同时过表达DNMT3B,Western blot检测DNMT3B的表达情况。并通过流式细胞术、CCK-8、Transwell细胞侵袭与迁移实验、Western blot检测各组处理后对喉鳞状细胞癌增殖、凋亡、侵袭与迁移及上皮间质转化的影响。<br>　　结果:<br>　　(1)双荧光素酶报告基因实验结果显示，在未突变ciRS-7或DNMT3B的UM-SCC-10A细胞中,miR-432-5p mimic转染后荧光素酶活性显著降低(P＜0.05);然而，在突变ciRS-7或DNMT3B后，miR-432-5pmimic转染对荧光素酶活性无显著影响(P＞0.05)，说明ciRS-7或DNMT3B可竞争性结合miR-432-5p。<br>　　(2)RIP 实验结果显示，与 IgG 组相比，miR-432-5p、ciRS-7 和 DNMT3B在Ago2组显著富集(P＜0.05)。<br>　　(3)RT-qPCR结果显示相较于癌旁组织，miR-432-5p在喉鳞状细胞癌组织中表达显著降低(P＜0.05)，DNMT3B在喉鳞状细胞癌组织中表达显著升高(P＜0.05);ciRS-7 与 miR-432-5p、miR-432-5p 与 DNMT3B 的表达水平均呈负相关。<br>　　(4)过表达miR-432-5p可抑制喉鳞状细胞癌增殖、侵袭与迁移及上皮间质转化，促进癌细胞凋亡(P＜0.05)。<br>　　(5)RT-qPCR 和 Western blot 结果显示，沉默 ciRS-7 促进 UM-SCC-10A和HN-4细胞中miR-432-5p的表达且抑制DNMT3B的表达(P＜0.05)。<br>　　(6)与沉默ciRS-7相比，同时沉默ciRS-7和miR-432-5p可致沉默ciRS-7对UM-SCC-10A和HN-4细胞的抑癌作用逆转(P＜0.05)。<br>　　(7)与沉默ciRS-7相比，沉默ciRS-7的同时过表达DNMT3B可致沉默ciRS-7对UM-SCC-10A和HN-4细胞的抑癌作用逆转(P＜0.05)。<br>　　小结:<br>　　(1)在 UM-SCC-10A 和 HN-4 细胞中，ciRS-7 通过直接结合 miR-432-5p抑制miR-432-5p的表达，miR-432-5p通过直接结合DNMT3B抑制DNMT3B的表达。<br>　　(2)ciRS-7通过miR-432-5p/DNMT3B轴促进喉鳞状细胞癌的增殖、侵袭与迁移及上皮间质转化，抑制癌细胞凋亡。<br>　　第三部分 ciRS-7通过miR-432-5p/DNMT3B调节TGM3的甲基化及表达发挥致癌作用<br>　　方法:<br>　　(1)通过StarBase数据库分析TGM3在头颈鳞癌中的表达，UCSC数据库预测TGM3启动子甲基化位点。<br>　　(2)MSP-PCR、RT-qPCR及Western blot检测在喉鳞状细胞癌细胞系HN-4中沉默ciRS-7或同时沉默ciRS-7和miR-432-5p后TGM3的甲基化水平变化和表达情况。<br>　　（3）在细胞系HN-4中沉默ciRS-7或同时沉默ciRS-7和TGM3,通过流式细胞术、CCK-8、Transwell细胞侵袭与迁移实验、Western blot检测各组处理后对喉鳞状细胞癌增殖、凋亡、侵袭与迁移及上皮间质转化的影响。<br>　　（4）通过裸鼠成瘤实验，在体内验证沉默ciRS-7对裸鼠异种移植瘤生长的影响，利用RT-qPCR和Western blot检测沉默ciRS-7对瘤体组织中miR-432-5p、DNMT3B和TGM3表达的影响。<br>　　结果:<br>　　（1）沉默ciRS-7后TGM3的甲基化水平下降，TGM3的表达量显著升高（P＜0.05）;而同时沉默ciRS-7和miR-432-5p,TGM3的甲基化水平升高，TGM3的表达量显著降低（P＜0.05）。<br>　　（2）与沉默ciRS-7相比，同时沉默ciRS-7和TGM3可致沉默ciRS-7对HN-4细胞的抑癌作用显著减弱（P＜0.05）。<br>　　（3）裸鼠成瘤实验中，沉默ciRS-7显著抑制裸鼠喉鳞状细胞癌移植瘤模型中肿瘤的体积（P＜0.05）。<br>　　（4）结果显示，沉默ciRS-7促进喉鳞状细胞癌移植瘤组织中miR-432-5p和 TGM3 的表达（P＜0.05），抑制 DNMT3B 的表达（P＜0.05）。<br>　　小结:<br>　　（1）ciRS-7可通过miR-432-5p/DNMT3B轴调节TGM3甲基化水平，进而影响喉鳞状细胞癌细胞增殖，侵袭与迁移、上皮间质转化和凋亡。<br>　　（2）沉默ciRS-7可通过上述途径在裸鼠体内抑制喉鳞状细胞癌移植瘤的生长。<br>　　结论:<br>　　（1）ciRS-7在喉鳞状细胞癌组织和细胞系中高表达，且ciRS-7的表达水平与患者淋巴结转移、肿瘤浸润深度及较高的临床分期密切相关。<br>　　(2)细胞实验表明miR-432-5p与ciRS-7和DNMT3B直接结合，ciRS-7通过抑制miR-432-5p的表达从而促进DNMT3B的表达。<br>　　(3)ciRS-7通过miR-432-5p/DNMT3B轴升高TGM3甲基化水平在体外促进喉鳞状细胞癌进程。沉默ciRS-7,导致其对miR-432-5p的竞争性结合能力减弱，miR-432-5p结合更多的DNMT3B,从而降低DNMT3B的表达，导致了TGM3甲基化水平的降低，促进TGM3转录表达，起到了抑制喉鳞癌细胞的增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化并促进癌细胞凋亡的作用。<br>　　(4)沉默ciRS-7可通过上述途径在裸鼠体内抑制喉鳞状细胞癌移植瘤的生长。