检索历史 清除

摘要免疫性血小板减少症(Immune thrombocytopenia,ITP)是一种获得性自身免疫性疾病，可导致孤立性血小板计数小于100×109/L,从而导致皮肤粘膜、内脏甚至颅内出血，严重威胁患者生命。目前ITP的发病机制尚不完全清楚，但T细胞介导的血小板破坏及血小板表面糖蛋白GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ的表达，是ITP进展过程中的关键因素。寻找慢性ITP患者与健康对照者外周血T细胞差异表达的关键基因(Hub基因)，有助于了解ITP的发病机制，从而寻求新的治疗靶点和生物标志物。另外，根据患者血小板表面膜糖蛋白特异性抗体的种类和生物标志物的表达，预测ITP患者的疗效，对于指导临床选择用药方案极为重要。由于同时具备检测多个样本、极高的灵敏度和最小的系统误差等特点，利用基因芯片数据进行生物信息学分析已用于识别多种自身免疫性疾病的Hub基因，包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等。然而，参与ITP发病和进展的Hub基因在很大程度上仍不清楚。<br>　　本研究主要分为两个部分:<br>　　1.结合GEO数据库，通过生物信息学分析筛选出与ITP发病相关的差异基因，并进行GO富集、KEGG通路分析、PPI网络构建，确定与ITP发病相关的Hub基因及关键通路。收集慢性ITP患者和健康对照者外周血标本，提取CD3+T细胞，通过qRT-PCR及Western Blot验证前期筛选出来的Hub基因。通过ELISA检测血清中差异性通路内各因子水平的变化并进行相关性分析。<br>　　2.收集慢性ITP患者外周血标本，行血小板表面膜糖蛋白特异性抗体GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ的检测，分析其中接受“大剂量地塞米松联合小剂量利妥昔单抗”治疗的ITP患者疗效与血小板表面膜糖蛋白特异性抗体之间的关系。并检测治疗缓解前后ITP患者的S100A8和TLR4表达水平，进行临床疗效预测。<br>　　第一部分:原发免疫性血小板减少症差异性通路内关键基因筛选和验证分析<br>　　目的：<br>　　用生物信息学方法筛选ITP患者的Hub基因并验证，利用相关性分析探索Hub基因与ITP发病的潜在关系。<br>　　方法：<br>　　1.从公共基因芯片数据库(GEO)中下载 1组ITP表达谱芯片数据，通过R软件的affy包对基因表达数据进行标准化预处理，包括背景矫正，归一化处理和log2变换。使用R软件的Limma包进行差异表达分析，筛选出ITP中差异表达基因(DEGs)。<br>　　2.使用GSEA软件和DAVID数据库进行DEGs的GO功能注释和KEGG通路分析，基于STRING数据库对DEGs进行编码蛋白相互作用网络关系(PPI)构建，利用MCC算法筛选具有高度连接性的Hub基因。<br>　　3.随机选取我院收治的慢性ITP患者30例，健康对照者26例，提取外周血单个核细胞(PBMCs),分离CD3+T细胞。<br>　　4.通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测Hub基因的mRNA表达量。<br>　　5.通过Western Blot检测Hub基因蛋白水平的表达量。<br>　　6.通过ELISA检测ITP患者和健康对照者Hub基因及关键通路内各因子水平的变化，并进行相关性分析。<br>　　结果：<br>　　1.慢性ITP组与对照组相比，差异倍数(fold change,FC)≥1.5倍时，DEGs共有97个，其中有63个基因表达明显上调，34个基因表达明显下调。<br>　　2.GO富集分析揭示DEGs主要参与先天性免疫应答、凋亡过程、中性粒细胞脱颗粒、免疫反应、蛋白质水解等生物学过程;参与胞外区、细胞表面、溶酶体等细胞组分;参与蛋白结合、锌离子结合、钙离子结合、蛋白质同源二聚化激活等分子功能。<br>　　3.KEGG通路分析提示DEGs主要富集于12条信号通路，包括IL-17信号通路、癌症中转录调控失调、NOD样受体信号通路、Th17细胞分化、Th1和Th2细胞分化、NF-kappa B信号通路、T细胞受体信号通路等。<br>　　结论：<br>　　1.ITP患者的外周血CD3+T细胞基因表达谱与正常对照相比存在97个差异表达基因，主要与先天性免疫应答和IL-17信号通路有关。<br>　　2.ITP患者S100A8和TLR4在mRNA和蛋白表达量及血清水平均显著高于健康对照组，可作为ITP患者未来治疗的新靶点。<br>　　3.S100A8通过与配体TLR4结合，激活IL-17信号通路，上调IL-17A表达水平，并与ITP发病的Th1极化相关。<br>　　第二部分:S100A8和TLR4及血小板表面膜糖蛋白特异性抗体对原发免疫性血小板减少症患者疗效预测分析<br>　　目的：<br>　　探讨血小板表面膜糖蛋白特异性抗体与ITP患者使用“大剂量地塞米松联合小剂量利妥昔单抗（HR-DXM+RTX）”疗效的关系，并结合S100A8和TLR4在ITP患者治疗缓解前后的表达水平预测疗效。<br>　　方法：<br>　　1.收集ITP患者外周血标本，GTI-PAKAUTO检测其血小板表面膜糖蛋白特异性抗体GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ。<br>　　2.回顾性分析使用“HR-DXM+RTX”方案治疗的126例ITP患者的临床资料，进行4周和6个月随访，计算其起效时间（TTR）,完全反应（CR）、总有效（OR）、无效（NR）的患者例数。<br>　　3.按照GPⅡb/Ⅲa自身抗体、GPⅠb/Ⅸ自身抗体进行分类，分析不同分类下其疗效，以及血小板表面膜糖蛋白特异性抗体对疗效的影响。<br>　　4.应用多因素logistic回归分析可能影响疗效的相关指标，包括性别、年龄、诊断类型、基线血小板数值、两种血小板抗体。采用析因设计分析两种血小板抗体对疗效的影响，以及两种抗体之间是否对疗效影响有交互作用。<br>　　5.检测治疗前及临床缓解后ITP患者及健康对照者S100A8和TLR4表达水平。并根据不同血小板抗体分类，进行S100A8和TLR4在治疗缓解前后的变化量分析。<br>　　结果：<br>　　1.总体疗效:4周随访时，56.4％的患者对“HR-DXM+RTX”治疗有效，中位TTR值为7天（范围4-28天）;6个月随访时，54.0％的患者有效。其中新诊断ITP患者4周CR率66.7％,总OR率为85.2％;6个月CR率为 59.3％，总 OR 率为 85.2％。<br>　　2.按血小板抗体分类:抗GPⅡb/Ⅲa双阳性组、单阳性组、抗GPⅠb/Ⅸ单阳性组、双阴性组的4周OR率分别为51.7％、78.3％、37.5％和68.4％，差异有统计学意义(P=0.022);4周CR率分别为30.0％、52.2％、16.7％、47.4％,差异有统计学意义(P=0.036)。抗GPⅡb/Ⅲa双阳性组、单阳性组、抗GPⅠb/Ⅸ单阳性组、双阴性组的6个月OR率分别为51.7％、78.3％、29.2％、63.2％,差异有统计学意义(P=0.007)，但是四组患者6个月CR率无明显统计学差异。进一步两两比较，发现4周和6个月OR率GPⅡb/Ⅲa(+)GPⅠb/Ⅸ(-)明显高于 GPⅡb/Ⅲa(-)GPⅠb/Ⅸ(+)组(P＜0.05)。<br>　　3.疗效影响因素:诊断类型，年龄，基线血小板计数，GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ自身抗体与患者对“HR-DXM+RTX”4周治疗反应有关。诊断，GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ自身抗体与患者对6个月治疗反应有关。未发现自身抗体种类间的交互作用。<br>　　结论：<br>　　1.抗GPⅠb/Ⅸ抗体阳性的ITP患者对“HR-DXM+RTX”治疗反应较差，对GPⅡb/Ⅲa抗体阳性的患者更推荐使用该方案。<br>　　2.诊断类型、GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ自身抗体是影响ITP患者使用“HR-DXM+RTX”治疗短期和长期疗效的预后因素，而年龄、基线血小板计数只影响该类患者短期疗效。<br>　　3.S100A8和TLR4可作为慢性ITP患者疾病缓解的生物标志物，通过检测其下降水平可对临床疗效进行一定预测。