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摘要卵巢过度刺激综合征(Ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS)是辅助生殖技术治疗中出现的一种严重医源性并发症，是卵巢对促性腺激素的过度反应导致。OHSS的核心在于毛细血管通透性增加，引起体液从血管内转移到第三间隙。目前认为血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是诱发OHSS的关键血管活性因子。除VEGF外，颗粒细胞芳香化酶表达增加导致血清雌激素水平升高也与OHSS发生密切相关。提早识别并预防OHSS发生对于改善体外受精(In vitro fertilization,IVF)妊娠结局具有重要意义。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(Secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)是一种基质相关的糖蛋白，在组织重塑和新生过程中发挥重要作用。既往研究显示，与卵泡期相比，SPARC在黄体颗粒细胞表达显著增加，起着调控黄体形成的作用。敲低人视网膜内皮细胞SPARC基因后，血管生成和内皮通透性下降。已有研究发现转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)和双调蛋白(Amphiregulin，AREG)在OHSS患者的卵泡液和颗粒细胞中均表达升高，并通过上调VEGF表达促进OHSS发生。卵巢内SPARC表达是否受到TGF-β1和AREG的调控，并参与OHSS发生，目前尚不清楚。因此，研究SPARC在OHSS发生的调控机制，有助于在分子水平上为OHSS的防治奠定理论基础并提供新的治疗靶点。本课题从以下三个部分展开研究:<br>　　1.探索SPARC对OHSS疾病发生的调控及作用机制;<br>　　2.探索TGF-β1对人颗粒细胞SPARC表达的调控及分子机制;<br>　　3.探索AREG对人颗粒细胞SPARC表达的调控及分子机制。<br>　　第一部分 SPARC上调卵巢颗粒细胞芳香化酶和内皮细胞VEGF表达参与OHSS发生<br>　　目的<br>　　探究SPARC在OHSS卵巢的差异化表达及调控OHSS发生的作用机制。<br>　　方法<br>　　1.免疫荧光实验验证SPARC在人原代黄素化颗粒细胞和人颗粒细胞样肿瘤细胞系KGN中的表达定位。<br>　　2.收集OHSS患者和非OHSS患者(Non-OHSS)的卵泡液及颗粒细胞，并构建OHSS大鼠模型，采用ELISA和RT-qPCR方法分别检测SPARC蛋白和mRNA表达，探索SPARC与OHSS发生的相关性。<br>　　3.选择KGN细胞系和人脐静脉内皮细胞系(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)进行机制研究。应用小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)敲低KGN和HUVEC细胞内源性SPARC表达，采用RT-qPCR和Western Blot方法检测相关分子的mRNA和蛋白水平。<br>　　4.收集行IVF助孕患者的颗粒细胞。采用ELISA方法检测卵泡液雌二醇和SPARC浓度，采用RT-qPCR方法检测颗粒细胞芳香化酶和SPARC mRNA表达，分别进行相关性分析。<br>　　结果<br>　　1.SPARC主要分布在人原代黄素化颗粒细胞和KGN细胞胞质中，在细胞核中低表达。<br>　　2.与非OHSS组(Non-OHSS)相比，OHSS患者卵泡液SPARC蛋白和颗粒细胞SPARC mRNA表达增加。<br>　　3.OHSS大鼠卵巢组织Sparc mRNA表达增加，而血清SPARC浓度与对照组相当。<br>　　4.敲低内源性SPARC基因，能够下调人颗粒细胞芳香化酶和内皮细胞VEGF表达。<br>　　5.人黄素化颗粒细胞SPARC mRNA与芳香化酶mRNA表达正相关，卵泡液中SPARC与雌二醇浓度也存在正相关关系。<br>　　结论<br>　　SPARC在OHSS卵巢表达升高，可能通过正性调节人颗粒细胞芳香化酶和人内皮细胞VEGF表达参与OHSS发生发展。<br>　　第二部分 TGF-β1上调人颗粒细胞SPARC表达及机制研究<br>　　目的<br>　　研究TGF-β1对人黄素化颗粒细胞SPARC表达的调控及分子机制。<br>　　方法<br>　　1.采用RT-qPCR方法检测OHSS大鼠卵巢Tgfb1 mRNA表达，并与Sparc mRNA表达进行相关性分析。<br>　　2.采用人原代颗粒细胞和KGN细胞系作为体外细胞模型，研究TGF-β1对SPARC表达的调控作用。应用化学性抑制剂阻断受体、siRNA方法敲低相应受体、信号通路和转录因子的表达，采用RT-qPCR和Western Blot方法检测SPARC mRNA和蛋白水平。<br>　　3.应用siRNA方法敲低内源性SPARC基因，采用RT-qPCR和Western Blot方法检测细胞VEGF和芳香化酶mRNA及蛋白水平。<br>　　结果<br>　　1.OHSS大鼠卵巢Tgfb1 mRNA表达增加，并与Sparc mRNA表达呈正相关。<br>　　2.TGF-β1促进人黄素化颗粒细胞和KGN细胞SPARC表达。<br>　　3.使用Ⅰ型TGF-β受体(Transforming growth factor-β receptor Ⅰ，TβRⅠ)抑制剂抑制受体活性或siRNA敲低内源性基因表达后，TGF-β1对SPARC的上调作用被阻断。<br>　　4.TGF-β1激活SMAD信号通路，应用SMAD3和转录因子Slug的特异性siRNA抑制内源性基因表达能够阻断TGF-β1对SPARC的促进作用。<br>　　5.TGF-β1能够活化p38 MAPK信号通路，使用通路抑制剂能够抑制TGF-β1对SPARC的诱导作用。<br>　　6.敲低内源性SPARC表达后，TGF-β1对颗粒细胞VEGF和芳香化酶的上调作用被阻断。<br>　　结论<br>　　TGF-β1通过与人颗粒细胞表面的TβRⅠ相结合，活化细胞内SMAD3和p38 MAPK信号通路以及转录因子Slug上调SPARC表达。SPARC介导TGF-β1对人颗粒细胞VEGF和芳香化酶表达的促进作用。<br>　　第三部分 AREG上调人颗粒细胞SPARC表达及机制研究<br>　　目的<br>　　研究AREG对人黄素化颗粒细胞SPARC表达的调控及分子机制。<br>　　方法<br>　　1.采用RT-qPCR方法检测OHSS大鼠卵巢Areg mRNA表达，并与Sparc mRNA表达进行相关性分析。<br>　　2.采用人原代颗粒细胞和KGN细胞系作为体外细胞模型，研究AREG对SPARC表达的调控作用。应用化学性抑制剂阻断受体、siRNA方法敲低受体内源性基因表达，并使用相关通路抑制剂进行阻断，采用Western Blot方法检测SPARC蛋白水平。<br>　　结果<br>　　1.OHSS大鼠卵巢Areg mRNA表达增加，并与Sparc mRNA表达呈正相关。<br>　　2.应用人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin,hCG)和AREG能促进人黄素化颗粒细胞SPARC表达。<br>　　3.使用表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制剂抑制受体活性或siRNA敲低内源性基因表达，AREG对SPARC的上调作用被阻断。<br>　　4.AREG能够活化ERK1/2、JNK、p38 MAPK和PI3K/AKT信号通路，使用通路抑制剂均能削弱AREG对SPARC表达的诱导作用。<br>　　结论<br>　　hCG上调人颗粒细胞SPARC表达。AREG通过结合人颗粒细胞表面的EGFR，随后活化细胞内ERK1/2、JNK、p38 MAPK和PI3K/AKT信号通路上调SPARC表达。