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摘要糖尿病肾脏疾病(Diabetickidneydisease，DKD)是糖尿病微血管病变的典型代表，但其发病机制尚未完全揭示，致使目前防治措施难以直击DKD核心机制，因此对患者生命健康造成巨大危害，成为导致终末期肾衰竭的重要原因。经典的“代谢-血流动力学失衡学说”、“氧化应激统一机制学说”为DKD研究奠定了基础，线粒体自噬、铁死亡、内质网应激、细胞焦亡等相关研究也对DKD的发病机制进行了丰富补充;但是，参与DKD的分子机制错综复杂、病理演进仍未完全明确、不同细胞及器官间互相作用尚待揭示，使我们依然无法还原DKD发生发展全貌。<br>　　肾小球内皮细胞(glomerularendothelialcells,GEC)、基底膜(glomerularbasementmembrane,GBM)和足细胞(podocytes,PC)共同组成了肾小球滤过屏障(glomerularfiltrationbarrier,GFB);PC附着于肾小球基底膜外侧，GEC附着于肾小球基底膜内侧，二者相互协作形成物理屏障及电荷屏障，是维持GFB完整的重要结构。然而在DKD状态下，高糖、氧化应激、炎症等多种因素可同时引起PC与GEC损伤，进一步导致肾小球滤过屏障受损，是导致蛋白尿发生的关键，也成为DKD标志性病理改变;更重要的是，DKD病理状态下二者细胞间通讯异常，进一步加剧GFB损伤、加速疾病进展。因此，足细胞-内皮细胞对话成为目前DKD领域的研究热点。<br>　　蛋白质翻译后修饰(Post-translationalmodification，PTM)指通过一系列酶促反应所实现的氨基酸共价修饰，在不改变氨基酸序列的前提下，影响蛋白质结构、定位、功能及降解过程。SUMO(SmallUbiquitin-likeModifier)分子介导的SUMO化修饰是一种可逆性PTM，参与糖尿病、动脉粥样硬化、恶性肿瘤等疾病的发生发展。既往研究证实，SUMO化修饰参与调控胰岛素合成、胰岛素抵抗、糖尿病慢性炎症反应等过程。尽管SUMO化修饰可能通过调控NF-κB、TGF-β等通路参与DKD发病，但具体机制尚不清楚;同时，SUMO化修饰与多种PTM存在协同/拮抗作用，其在DKD病变过程中的作用有待揭示。<br>　　为此，本研究首先通过生物信息学分析，筛选出糖尿病肾病模型及高糖环境下小鼠足细胞中差异表达的去SUMO化酶——SENP6;之后围绕去SUMO修饰及效应，揭示SENP6参与DKD小鼠足细胞-内皮细胞对话的具体机制:一方面,SENP6通过减少N1ICD的SUMO化修饰，抑制高糖状态下Notch1信号通路的异常激活，改善小鼠足细胞凋亡;另一方面，SENP6通过抑制小鼠足细胞去甲基化酶KDM6A的SUMO化修饰，增加EDN1启动子区域H3K27me2/3修饰，从而减少EDN1的合成分泌，改善内皮细胞氧化应激与结构损伤。<br>　　第一部分SENP6抑制Notch1通路激活减轻高糖诱导的小鼠足细胞凋亡<br>　　目的<br>　　观察去SUMO化酶SENP6在糖尿病小鼠肾小球及PC中的表达，探索SENP6改善高糖诱导的小鼠PC细胞周期阻滞及凋亡的具体机制。<br>　　方法<br>　　1.运用生物信息学手段结合GEO数据集(GSE20844、GSE30528、GSE33744)进行筛选;C57BL/6J小鼠注射枸橼酸缓冲液作为对照(Control组)、以STZ诱导构建1型糖尿病小鼠模型(STZ组)，通过免疫荧光组织化学(IFHC)、实时荧光定量PCR(RT-PCR)、WesternBlot验证候选基因。<br>　　2.将C57BL/6J小鼠建模后分为Control组、STZ组，并通过腺相关病毒鼠尾静脉注射构建STZ+sh-NC组和STZ+sh-SENP6组，ELISA检测各组血、尿生化指标，免疫组织化学（IHC）检测小鼠肾小球SENP6及Podocin表达。<br>　　3.小鼠足细胞MPC5转染后分为SENP6干扰组（sh-SENP6，SH组）及对照组（sh-NC，NC组），构建mRNA转录组并进行富集分析。<br>　　4.IHC检测各组小鼠肾小球Ki67表达;将MPC5细胞按照干预条件分为①正常浓度葡萄糖组（5mM葡萄糖，NG组）、②高浓度葡萄糖组（30mM葡萄糖，HG组）、③甘露醇高渗组（25mM甘露醇+5mM葡萄糖，MA组），转染后分为④高糖sh-SENP6干预组（HG+sh-SENP6组）、⑤高糖pcDNA-SENP6过表达组（HG+SENP6组），细胞免疫荧光化学（IF）检测Ki67表达，同时评估足细胞损伤情况，包括细胞周期、LDH细胞毒性实验及AnnexinⅤ-FITC/PI法评估凋亡水平，此外，以WesternBlot检测足细胞标志蛋白与细胞周期蛋白表达水平。<br>　　5.基于生物信息学分析结果，IHC及WesternBlot检测小鼠Hes1、SENP6及N1ICD表达;RT-PCR检测足细胞Notch1、Hes1、Hey1的mRNA表达，WesternBlot检测足细胞N1ICD、Notch1FL、Hes1、Hey1。<br>　　6.在HG组及HG+sh-SENP6组基础上加用Notch1通路抑制剂DAPT,检测各组足细胞细胞周期及细胞凋亡情况。<br>　　结果<br>　　1.筛选SENP6作为目的基因:对于数据集进行筛选，发现SNCA,PAFAH1B1，RAB14,SENP6,H2AFJ,CDC27,RABGAP1L,WBP1L,KPNA1等9个候选基因;经验证，STZ组小鼠肾小球中SENP6、H2AFJ、RABGAP1L、KPNA1、SNCA的mRNA表达较Control组降低(均P＜0.05)，仅SENP6mRNA表达与小鼠24h-UALB呈负相关(r=-0.628，95％CI:-0.861～-0.166,P=0.0128)。IFHC及WesternBlot示Control组SENP6表达高于STZ组(P＜0.0001;P=0.0003)。<br>　　2.SENP6沉默加重STZ小鼠PC损伤:STZ+Sh-SENP6组小鼠在血糖、体重、肾重指数上与STZ+Sh-NC小鼠无统计学差异，但血肌酐、尿素氮及24小时尿微量蛋白水平明显升高（均P＜0.05）;IHC结果显示，STZ组小鼠肾小球podocin表达与Control组相比降低（P＜0.01）,STZ+Sh-NC组与STZ组表达无差异（P＞0.05）,STZ+sh-SENP6组较STZ+Sh-NC组进一步下降（P＜0.05）。<br>　　3.构建SENP6沉默PC转录组并行富集分析:针对SH组及NC组构建mRNA差异表达谱，以P＜0.05、FDR＜0.1、FoldChange＞1.5进行筛选后，SH组与NC组相比上调基因1272个、下调基因1912个;GO分析结果提示，SENP6沉默后生物学过程改变集中于细胞周期调控、细胞有丝分裂等，KEGGPathway分析示差异表达mRNA富集于Notch通路、细胞外基质作用通路等。<br>　　4.SENP6沉默加重PC细胞周期阻滞及凋亡:IHC示STZ组肾小球中Ki67表达明显升高（P＜0.01），STZ+sh-SENP6组肾小球中Ki67表达较STZ+sh-NC组明显升高（P＜0.01）。细胞实验中，与NC组PC相比，HG组Ki67表达明显升高(P＜0.05），足细胞阻滞于S期（P＜0.01）及G2/M期（P＜0.001），细胞周期蛋白CDK4、CyclinD1、CyclinB1表达明显升高，LDH漏出率及细胞凋亡率均升高（P＜0.01）;Sh-SENP6干预进一步加重上述损伤（均P＜0.05），而SENP6过表达则改善上述效应（均P＜0.05），MA组与NG组上述指标无差异（均P＞0.05）。<br>　　5.SENP6沉默促进Notch1通路激活:与Control组小鼠相比，STZ组小鼠肾小球SENP6蛋白表达下降，伴随以N1ICD及Hes1蛋白表达明显升高，而STZ+Sh-SENP6组小鼠N1ICD及Hes1蛋白表达进一步升高。细胞实验中，与NG组相比，HG组Notch1FL（Notch1蛋白全长）、N1ICD（Notch1蛋白胞内段）、Hes1及Hey1表达均升高;Sh-SENP6干预后Notch1的mRNA及Notch1FL表达无明显改变（P＞0.05）,N1ICD、Hes1及Hey1均明显升高（均P＜0.01）;SENP6过表达则逆转高糖诱导的N1ICD、Hes1、Hey1升高（均P＜0.05）,但对Notch1FL的蛋白水平无影响（P＞0.05）。<br>　　6.DAPT改善高糖及SENP缺失所致小鼠PC损伤:DAPT干预降低高糖诱导的MPC5细胞凋亡水平（P＜0.01）,且减少阻滞于G2/M期的细胞数量（P＜0.01）;同时，Sh-SENP6转染后经DAPT处理可逆转Sh-SENP6引起的细胞凋亡（P＜0.0001）及细胞周期阻滞（P＜0.001）。<br>　　结论<br>　　高糖诱导小鼠足细胞SENP6表达降低，通过激活Notch1通路导致细胞周期阻滞与细胞凋亡。<br>　　第二部分SENP6介导N1ICD去SUMO化修饰的调控作用与机制研究<br>　　目的<br>　　探索SENP6通过去SUMO化修饰调控N1ICD表达及作用的详细机制。<br>　　方法<br>　　1.MPC5细胞分成①NG组、②HG组、③MA组、④HG+sh-SENP6组、⑤HG+SENP6组;HEK293T细胞转染质粒分为①空白组、②Myc-N1ICD组、③Myc-N1ICD+HA-SUMO3组、④Myc-N1ICD+HA-SUMO3+Flag-SENP6组;小鼠经STZ诱导后分为STZ+sh-NC组和STZ+sh-SENP6组。通过免疫共沉淀(Co-IP)检测各组细胞N1ICD(Myc)与SUMO2/3(HA)的结合水平。<br>　　2.通过SUMO化位点预测工具SUMOsp和SUMOplotTMAnalysisProgram,对于N1ICD的SUMO化位点进行预测，构建Myc-WTN1ICD及Myc-K2043RN1ICD、Myc-K2246RN1ICD突变型质粒及相关质粒转染293T细胞，分为①Myc-WTN1ICD+HA-SUMO3、②Myc-WTN1ICD+HA-SUMO3+FLAG-SENP6、③Myc-K2043RN1ICD+HA-SUMO3、④Myc-K2043RN1ICD+HA-SUMO3+FLAG-SENP6、⑤Myc-K2246RN1ICD+HA-SUMO3、⑥Myc-K2246RN1ICD+HA-SUMO3+FLAG-SENP6组，Co-IP检测各组细胞N1ICD(Myc)与SUMO3(HA)的结合水平。<br>　　3.将双荧光素酶报告载体pGL3-HES1及相关质粒转染293T细胞，分为①Myc-N1ICD、②Myc-N1ICD+HA-SUMO3、(3)Myc-N1ICD+HA-SUMO3+Flag-SENP6、④Myc-K2246RN1ICD+HA-SUMO3、⑤Myc-K2246RN1ICD+HA-SUMO3+Flag-SENP6,双荧光素报告基因检测各组Hes1启动子活性。<br>　　4.将MPC5细胞分为①HG组、②HG+Sh-SENP6组、③HG+SENP6组、④HG+Myc-N1ICD组、⑤HG+Myc-K2246RN1ICD组，进行CHX追踪实验，联合蛋白酶体抑制剂MG132干预，WesternBlot检测N1ICD蛋白表达，Co-IP检测N1ICD(Myc)与泛素分子(Ub)结合。<br>　　5.将293T细胞转染后进行分组:①Myc-N1ICD+His-UB组、②Myc-N1ICD+HA-SUMO3+His-UB组、③Myc-N1ICD+HA-SUMO3+Flag-SENP6+His-UB组、④Myc-K2246R-N1ICD+His-UB组、⑤Myc-K2246R-N1ICD+HA-SUMO3+His-UB组、⑥Myc-K2246R-N1ICD+HA-SUMO3+Flag-SENP6+His-UB组，Co-IP检测各组N1ICD(Myc)与泛素(His)的结合。<br>　　结果<br>　　1.SENP6介导N1ICD的去SUMO化修饰:MPC5细胞中，内源性N1ICD可结合SUMO2/3,过表达SENP6可降低二者结合;293T细胞中，外源性N1ICD可结合SUMO3,而SENP6过表达后二者结合减少;在STZ诱导小鼠肾小球中，SENP6缺失导致N1ICD与SUMO3结合增加。<br>　　2.SENP6调控小鼠N1ICDK2246位点的SUMO化修饰:预测结果提示mK2043/hK2043和mK2246/hK2252为N1ICD潜在SUMO化修饰位点;Co-IP结果显示，与WT-N1ICD相比，K2043R-N1ICD与SUMO3结合无变化，K2246R-N1ICD与SUMO3结合水平降低;共转染FLAG-SENP6表达质粒抑制WT-N1ICD、K2043R-N1ICD与SUMO3结合，而对K2246R-N1ICD无影响。<br>　　3.SENP6抑制N1ICD转录活性:N1ICD经SUMO3修饰后其转录活性增强（P＜0.01）;SENP6通过减少N1ICD的SUMO化修饰，抑制其转录活性（P＜0.01）;而K2246R-N1ICD转录活性较N1ICD降低（P＜0.05），过表达SENP6无法进一步降低其转录活性（P＞0.05）。<br>　　4.SENP6促进N1ICD蛋白降解:CHX追踪实验示，与HG组MPC5细胞相比，HG+Sh-SENP6组N1ICD的降解速度减缓（3h、12h，P＜0.05）,而HG+SENP6组N1ICD的降解速度增加（6h、12h、24h,P＜0.05）;K2246RN1ICD相较于N1ICD降解速度增加（6h、12h、24h,P＜0.05）。在CHX联合MG132干预后，可以阻断SENP6对N1ICD蛋白降解的促进作用。<br>　　5.SENP6通过去SUMO化修饰介导N1ICD泛素化降解:MPC5细胞中，SENP6过表达促进N1ICD蛋白与泛素分子结合，而Sh-SENP6降低N1ICD蛋白泛素化水平;与N1ICD相比，K2246RN1ICD蛋白的泛素化水平明显增加。HEK293T细胞中，经SUMO3修饰的N1ICD泛素化水平降低，SENP6通过去SUMO化作用促进N1ICD泛素化修饰，而K2246R突变型N1ICD泛素化水平较恒定。<br>　　结论SENP6可以介导小鼠足细胞N1ICD发生去SUMO化修饰，抑制其转录活性并促进其泛素化降解。<br>　　第三部分SENP6通过KDM6A改善糖尿病足细胞-内皮细胞对话的机制研究<br>　　目的<br>　　探索SENP6调控糖尿病肾病足细胞-内皮细胞对话的效应及详细机制。<br>　　方法<br>　　1.通过IFHC检测Control组、STZ组、STZ+Sh-SENP6组及STZ+Sh-NC组小鼠肾小球VE-cadherin、CD31表达及定位。<br>　　2.将PC分为NG组、HG组、HG+sh-SENP6组、HG+SENP6组，提取PC培养上清液(PSN)与小鼠原代GEC共培养，分为①NGPSN组、②HGPSN组、③(HG+Sh-SENP6)PSN组、④(HG+SENP6)PSN组;DCFH-DA荧光探针检测各组内皮细胞ROS水平，IF检测各组VE-cadherin表达，麦胚凝集素(WGA)荧光染色评估GEC糖蛋白标记物水平。<br>　　3.高糖处理PC0h、6h、24h、48h后，RT-PCR及ELISA检测EDN1mRNA表达及上清液EDN1蛋白水平;进一步检测NG组、HG组、HG+sh-SENP6组、HG+SENP6组EDN1的mRNA及上清液EDN1蛋白表达，同时检测各组小鼠肾小球EDN1的mRNA水平。<br>　　4.将GEC与不同条件处理后的PC上清液共培养，分为①100％HGPSN组、②100％(HG+Sh-EDN1)PSN组、③50％HGPSN+50％NGPSN组、④100％(HG+Sh-SENP6)PSN组、⑤50％(HG+Sh-SENP6PSN)+50％NGPSN组，MitoSox检测各组线粒体ROS水平;随后加入内皮素A受体的拮抗剂-BQ123,进行各组VE-cadherin及WGA荧光染色。<br>　　5.将PC分为NG组、MG组、HG组、HG+sh-SENP6组、HG+SENP6组，检测各组H3K27me1/2/3、meH3K9甲基化修饰水平;染色质免疫共沉淀(CHIP)检测各组EDN1启动子H3K27me2/3及KDM6A的结合情况并进行区域富集分析。以Sh-KDM6A及Sh-SENP6干预高糖培养PC,CHIP检测各组EDN1启动子H3K27me2/3结合情况，同时检测EDN1的mRNA及上清液EDN1蛋白水平。<br>　　6.将PC分为NG组、MG组、HG组、HG+sh-SENP6组、HG+SENP6组;在HEK293T细胞中转染pGL3-EDN1及相关质粒后分为:①Myc-KDM6A组、②Myc-KDM6A+Flag-SENP6组、③Myc-KDM6A+HA-SUMO3组及④Myc-KDM6A+Flag-SENP6+HA-SUMO3组;小鼠分为:Control组、STZ组、STZ+Sh-NC组及STZ+Sh-SENP6组;Co-IP检测各组KDM6A(Myc)与SUMO2/3结合情况。<br>　　7.在HEK293T细胞中转染质粒后分为:①Myc-KDM6A组、②Myc-KDM6A+Flag-SENP6组、③Myc-KDM6A+HA-SUMO3组及④Myc-KDM6A+Flag-SENP6+HA-SUMO3组，双荧光素酶实验检测各组EDN1启动子转录活性，CHIP检测各组EDN1基因启动子区H3K27me3与KDM6A的富集水平。<br>　　8.将GEC与不同处理后的PC上清液共培养，分为①HGPSN组、②HG+Sh-KDM6APSN组、③HG+Sh-SENP6PSN组、④HG+Sh-SENP6+Sh-KDM6APSN组，MitoSox检测各组线粒体ROS水平，IF检测各组VE-cadherin水平及WGA荧光染色。<br>　　结果<br>　　1.沉默SENP6加重小鼠肾小球GEC损伤:STZ小鼠肾小球中GEC组织间黏连相关分子VE-cadherin及CD31表达量减少;而SENP6沉默后进一步降低标记蛋白表达，提示SENP6沉默进一步加重高糖导致的GEC屏障破坏。<br>　　2.SENP6沉默PC的上清液加重GEC损伤:与NGPSN组相比，HGPSN组GEC中ROS水平增加（P＜0.0001）、VE-cadherin（P＜0.01）及WGA荧光密度降低（P＜0.001）,（HG+Sh-SENP6）PSN组的GEC氧化应激及结构损伤进一步加重（均P＜0.05），而（HG+SENP6）PSN改善高糖引起的GEC损伤（均P＜0.05）。<br>　　3.SENP6沉默加重高糖诱导的足细胞EDN1分泌:高糖处理24h后，PC中EDN1的mRNA及上清液中EDN1的蛋白含量均明显升高（与0h相比，均P＜0.01），继续处理至48h无进一步上升（均P＞0.05）;SENP6沉默促进高糖诱导的EDN1分泌（mRNA水平，P＜0.05;蛋白水平，P＜0.01），而SENP6过表达降低EDN1表达与分泌（均P＜0.05）。同时，SENP6沉默增加糖尿病小鼠肾小球中EDN1的mRNA水平。<br>　　4.SENP6沉默的PC通过分泌EDN1引起GEC损伤:MitoSOX结果提示，100％（HG+Sh-EDN1）PSN组及50％HGPSN+50％NGPSN组较100％HGPSN组GECs细胞的线粒体ROS水平均降低（P＜0.001;P＜0.05），100％（HG+Sh-SENP6）PSN组较100％HGPSN组GECs细胞的线粒体ROS水平显著增加（P＜0.0001），50％（HG+Sh-SENP6）PSN+50％NGPSN组较100％（HG+Sh-SENP6）PSN组线粒体ROS水平均显著降低（P＜0.0001）。加入BQ123后，VE-cadherin以及WGA荧光密度有所升高（P＜0.001;P＜0.01），且改善足细胞SENP6沉默后上清液对于GEC的损伤作用（P＜0.001;P＜0.001）。<br>　　5.SENP6调节EDN1启动子的组蛋白H3K27me2/3甲基化水平:HG组MPC5细胞H3K27me2/3表达降低，SENP6沉默进一步降低H3K27me2/3表达，SENP6过表达增加H3K27me2/3水平，而H3K27me1、meH3K9表达无明显改变;CHIP证实，HG组EDN1启动子区域H3K27me2/3富集水平较NG组下降，HG+Sh-SENP6组H3K27me2/3富集水平进一步下降，HG+SENP6组H3K27me2/3富集程度提高，以启动子-1K附近区域为著（均P＜0.05）。<br>　　6.SENP6通过KDM6A调节EDN1基因H3K27me2/3甲基化:CHIP显示，与NG组相比，HG组EDN1启动子区域KDM6A结合增加，以-1kbp区域最为显著;HG+Sh-SENP6组的富集程度进一步增加，而HG+SENP6组的富集被抑制（均P＜0.05）。sh-SENP6干预后，EDN1启动子上游1kbp处H3K27me2/3的富集水平减少,而同时沉默KDM6A能够恢复H3K27me2/3的富集水平（均P＜0.05）。沉默KDM6A能够降低HG诱导的EDN1表达，并逆转SENP6沉默对于EDN1转录和蛋白合成的促进作用（均P＜0.05）。<br>　　7.SENP6可以减少KDM6A的SUMO化修饰:MPC5细胞中，HG组KDM6A的SUMO2/3化修饰水平增加，HG+Sh-SENP6组二者结合进一步增加，HG+Sh-SENP6过表达则减少KDM6A的SUMO2/3化修饰;HEK293T细胞中，外源性SENP6过表达可减弱KDM6A（Myc标签）蛋白与SUMO2/3（HA标签抗体）的结合;STZ诱导糖尿病小鼠模型中，KDM6A与SUMO2/3的结合增加，SENP6沉默后，KDM6ASUMO化修饰进一步增加。<br>　　8.SENP6通过KDM6A抑制EDN1转录:KDM6A的SUMO化修饰增加了EDN1启动子转录活性，SENP6过表达逆转了上述效应（均P＜0.01）;CHIP实验证实，Myc-KDM6A与HA-SUMO3互作可以增加KDM6A在EDN1启动子区域的富集程度，进而降低启动子H3K27me3的富集水平，SENP6过表达则部分逆转了上述效应（均P＜0.05）。<br>　　9.SENP6通过KDM6A抑制PC分泌EDN1，改善GEC功能:与HGPSN组相比，HG+Sh-KDM6APSN组GEC的线粒体ROS水平降低、VE-cadherin荧光以及WGA染色强度增加;而HG+Sh-SENP6PSN组较HGPSN组线粒体ROS水平增加、VE-cadherin荧光以及WGA染色强度降低;HG+Sh-SENP6+Sh-KDM6APSN组较HG+Sh-SENP6PSN组线粒体ROS水平的降低、VE-cadherin荧光以及WGA染色强度增加（均P＜0.05）,提示足细胞中沉默KDM6A可逆转干扰SENP6所致的GEC损伤。<br>　　结论<br>　　SENP6介导KDM6A去SUMO化修饰并增加EDN1启动子的H3K27me2/3修饰，从而抑制足细胞EDN1合成分泌，改善内皮细胞结构功能。<br>　　全文结论<br>　　1.高糖诱导小鼠足细胞SENP6表达降低，通过激活Notch1通路导致细胞周期阻滞与细胞凋亡<br>　　2.SENP6可以介导小鼠足细胞N1ICD发生去SUMO化修饰，抑制其转录活性并促进其泛素化降解<br>　　3.SENP6通过减少KDM6A的SUMO化修饰抑制EDN1表达，改善糖尿病小鼠足细胞-内皮细胞对话。