检索历史 清除

摘要目的:<br>　　组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(Lysine specific demethylase 1,LSD1)是一个黄素依赖的胺基氧化酶，通过去除H3K4me1/2和H3K9me1/2的甲基化修饰调控基因表达。LSD1已被证实在多种肿瘤组织中表达均上调，与肿瘤形成、增殖、侵袭转移和分化等过程等密切相关，被认为是新的治疗肿瘤的重要靶点。目前虽然已有多个LSD1抑制剂进入临床研究，但其作用的具体分子机制依然不清楚，这不利于LSD1抑制剂的研发和临床应用。<br>　　铁死亡是细胞内铁过度积累使脂质过氧化物增多的新型细胞程序性死亡方式。已有研究表明多种表观遗传调节蛋白和铁死亡密切相关，但是LSD1如何调节铁死亡尚未报道。本研究首次考察了抑制LSD1是否能够诱导非小细胞肺癌(NSCLC)细胞铁死亡并探索了具体分子机制，且探究了 LSD1抑制剂与铁死亡诱导剂(1S,3R)-RSL3(RSL)联合用药的抗肿瘤作用。<br>　　方法与结果:<br>　　1.抑制LSD1诱导NSCLC细胞铁死亡<br>　　在NSCLC细胞系中，我们发现LSD1特异性小分子抑制剂ORY-1001(ORY)和GSK-LSD1 2HC1(GSK)对A549和H1975细胞株表现出较强的抑制效果。进一步通过流式细胞仪的检测发现，ORY可以显著促进敏感细胞系的细胞脂质ROS水平的升高，但对抑制剂不敏感的细胞系则没有这种效果。脂质ROS水平的升高是铁死亡的重要表征之一，因此，我们猜测对LSD1抑制剂敏感的细胞株可能发生了铁死亡。为了进一步验证此现象，我们使用了不同的细胞死亡抑制剂，结果发现有且只有铁死亡抑制剂(Fer-1)逆转LSD1抑制剂诱导的细胞死亡。<br>　　进一步研究发现LSD1小干扰RNA(siLSD1)介导的LSD1表达量敲低也可以显著升高A549和H1975细胞株的脂质ROS和总ROS。这些结果说明抑制LSD1诱导的NSCLC细胞发生铁死亡。<br>　　2.LSD1 通过 TFRC/ACSL4/ATF4-SLC7A11 通路调节铁死亡<br>　　(1)抑制LSD1上调TFRC促进铁死亡<br>　　首先，我们通过SRB实验检测细胞内Fe2+含量，发现ORY可以上调NSCLC细胞内Fe2+含量。为了进一步考察LSD1抑制剂诱导的细胞死亡是不是Fe2+依赖的，在A549和H1975细胞中我们将铁离子螯合剂去铁胺(DFO)与ORY合用，发现DFO可以有效抑制ORY诱导的细胞死亡。该结果说明LSD1抑制剂促进细胞Fe2+蓄积促进铁死亡。转铁蛋白受体(TFRC)，是生物体内促进铁积累的重要基因，其能够促进铁死亡。因此探究TFRC如何参与LSD1调节铁死亡发生发展的明确机制至关重要。Western Blot检测发现LSD1抑制剂上调NSCLC细胞株TFRC的蛋白表达，而且敲低TFRC逆转了 LSD1抑制剂诱导的脂质ROS增加和细胞死亡。综上所述，该结果阐明了 LSD1抑制剂通过上调TFRC促进细胞内Fe2+积累，从而诱导铁死亡。<br>　　(2)抑制LSD1上调ACSL4诱导铁死亡<br>　　长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)是促进铁死亡的重要靶点，我们研究发现在NSCLC细胞株中，LSD1抑制剂可以显著上调ACSL4的蛋白表达。进一步研究发现siLSD1介导的LSD1表达量敲低也可显著升高A549和H1975细胞株ACSL4的蛋白表达。为了验证ACSL4在LSD1调节铁死亡中的作用，我们构建了 ACSL4敲低细胞株A549-siACSL4和H1975-siACSL4,并发现敲低ACSL4逆转了 LSD1抑制剂诱导的脂质ROS增加和细胞死亡。该结果说明抑制LSD1能够上调ACSL4从而诱导铁死亡。<br>　　(3)抑制LSD1下调ATF4-SLC7A11信号通路诱导铁死亡<br>　　TCGA数据库分析显示SLC7A11在肺腺癌组织中的表达水平显著高于正常组织，为深入探究SLC7A11在肺腺癌发展过程中的生物学功能，我们利用 SLC7A11 小干扰 RNA(siRNA)构建 A549-siSLC7A11 和 H1975-siSLC7A11细胞株。发现沉默SLC7A11可显著降低NSCLC细胞的谷胱甘肽(GSH)合成能力和细胞活力，而且该能力可以被抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)和二硫苏糖醇(DTT)所恢复。<br>　　接着，我们探讨了 LSD1调节SLC7A11的作用。我们发现使用LSD1抑制剂或敲低LSD1可以显著下调A549和H1975细胞株中的SLC7A11的mRNA和蛋白水平，而且抑制GSH合成，然而对其他NSCLC细胞株没有影响。为进一步探讨SLC7A11在LSD1调节铁死亡中的作用，我们构建了 A549-OESLC7A11和H1975-OESLC7A11(SLC7A11过表达)细胞株。实验发现过表达SLC7A11可以显著逆转ORY的细胞杀伤和抑制GSH合成的能力。<br>　　上述实验结果提示抑制LSD1下调SLC7A11诱导铁死亡。为了进一步探讨LSD1调节SLC7A11的机制，本课题组检测了 ORY对SLC7A11上游靶点(如 P53,STAT3,ATF3,ARNTL,BACH1 和 ATF4)mRNA 或蛋白水平的影响，发现LSD1可能是通过调节ATF4影响SLC7A11的。为了验证此推测，本课题组构建了 A549/H1975-OEATF4 和 A549/H1975-OEATF4 siSLC7A11,即单独过表达ATF4和过表达ATF4再敲低SLC7A11的细胞株，发现单独过表达ATF4的细胞株可以逆转ORY引起的细胞死亡和GSH的下降，而过表达ATF4再敲低SLC7A11则恢复ORY的细胞杀伤和下调GSH的能力。该结果说明LSD1抑制剂是通过下调ATF4,从而下调SLC7A11,进而抑制GSH合成，最终导致细胞死亡。<br>　　接着，我们对LSD1调控ATF4的相关机制进行探讨，本研究通过使用染色质免疫共沉淀(ChIP)-qPCR实验，在ATF4转录起始位点上游1000bp至下游400bp区域设计了 6对引物，发现LSD1抑制剂通过促进转录抑制因子H3K9me2 在 ATF4 启动子(-1000，-760)和(-790，-650)的修饰抑制 ATF4 转录。<br>　　总之，上述结果发现LSD1抑制剂通过促进H3K9me2在ATF4启动子(-1000,-760)和(-790，-650)的修饰抑制ATF4转录，从而抑制SLC7A11的转录和翻译，进而抑制GSH合成，最终诱导铁死亡。<br>　　3.LSD1抑制剂与铁死亡诱导剂1S,3R-RSL3(RSL)具有协同抗肿瘤作用<br>　　除了进行LSD1影响铁死亡的机制探索，我们还通过体内体外探索了LSD1抑制剂和铁死亡诱导剂RSL是否具有协同抗肿瘤作用。<br>　　体外实验中，我们将LSD1抑制剂与RSL联合处理A549和H1975细胞，再通过SRB法测定细胞活力变化，进一步采用常用的Chou-Talalay计算各组不同浓度ORY与RSL联合作用系数CI值(CI＜1表示具有显著协同效应)，结果显示CI＜1,两者具有协同抗肿瘤效应。为了进一步验证LSD1抑制剂联合RSL是否诱导肿瘤细胞发生了铁死亡，通过流式细胞仪检测不同分组细胞的脂质ROS,总ROS水平的变化，GSH试剂盒检测细胞GSH水平的变化，及铁死亡相关基因的蛋白表达情况。研究发现，与单药组比较，两药联用能够进一步增加脂质ROS、总ROS水平和TFRC和ACSL4的蛋白表达,且能够进一步降低GSH含量和SLC7A11的蛋白含量。<br>　　接着，我们构建了 A549裸鼠皮下移植瘤模型，在动物水平检测LSD1抑制剂与RSL联合使用的抗肿瘤能力以及瘤组织的丙二醛（MDA）、GSH以及铁死亡相关蛋白的含量。本实验结果表明，相较于单独使用RSL时，LSD1抑制剂联合RSL后能明显诱导抑制肿瘤的生长，而且瘤组织中铁死亡代谢产物MDA显著升高，GSH含量显著降低，TFRC和ACSL4的蛋白表达进一步升高，SLC7A11的蛋白含量进一步降低。这些结果说明LSD1抑制剂增强了RSL的抗肿瘤能力，而且是通过调节TFRC/ACSL4/ATF4-SLC7A11途径促进铁死亡。<br>　　结论:<br>　　本论文首次发现抑制LSD1可以诱导NSCLC细胞发生铁死亡，其机制为:1）抑制LSD1通过上调TFRC表达，从而促进细胞内Fe2+含量，最终诱导铁死亡。2）抑制LSD1通过上调ACSL4表达，从而诱导铁死亡。3）抑制LSD1通过促进H3K9me2在ATF4启动子的修饰抑制ATF4转录，从而抑制SLC7A11的转录和翻译，进而抑制GSH合成，最终诱导铁死亡。此外，还发现LSD1抑制剂能够增强RSL的抗肿瘤作用，两药在体内外均具有协同抗肿瘤疗效。这些发现为进一步揭示LSD1的生物学功能及基于LSD1的抗肿瘤药物研发提供实验基础和理论依据。