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摘要目的:<br>　　1.通过生物信息学分析筛选出可能对SOX9具有调控作用的目标lncRNA。<br>　　2.通过体内、外实验，研究SOX9和目标lncRNA在KOA患者膝关节软骨和成软骨分化过程中的表达情况，明确两者的调控关系;研究关节康片干预对KOA小鼠关节软骨目标lncRNA和SOX9表达的影响。<br>　　3.研究目标lncRNA对MSCs成软骨分化的调控作用;研究敲低或过表达目标lncRNA慢病毒感染MSCs注射对裸鼠膝关节软骨缺损的修复作用。<br>　　4.通过对敲低或过表达目标lncRNA的MSCs及对照组MSCs进行转录组学测序分析，筛选出关键差异表达基因和关键信号通路。<br>　　5.探究关节康片基于目标lncRNA调控关键信号通路对OA的作用机制。<br>　　方法:<br>　　1.通过基因组序列的生物信息学扫描分析，筛选出目标lncRNA。<br>　　2.收集KOA患者膝关节软骨标本和临床资料，通过RT-qPCR实验分别检测SOX9和目标lncRNA在KOA患者膝关节软骨和在体外MSCs成软骨分化过程中的表达，明确两者的相关性和调控关系。通过多元线性回归分析目标lncRNA在KOA患者膝关节软骨中表达的临床影响因素。<br>　　3.通过RNA核质分离试验明确目标lncRNA在MSCs细胞核和细胞质的表达情况。<br>　　4.构建敲低或过表达目标lncRNA的慢病毒质粒，经包装后收集病毒粒子分别感染MSCs,筛选获得敲低或过表达该lncRNA的MSCs。采用RT-qPCR实验检测目标lncRNA的表达，以及SOX9和软骨相关基因在敲低或过表达MSCs成软骨分化过程中的表达。采用Alcian blue和Safranine O染色法检测慢病毒感染MSCs成软骨细胞分化的效果，以此评估目标lncRNA对MSCs成软骨分化的调控作用。<br>　　5.构建裸鼠膝关节软骨缺损模型，将敲低或过表达目标lncRNA慢病毒感染MSCs和VitroGel水凝胶混合物注射至裸鼠膝关节软骨缺损处。建模4周后处死动物，取膝关节标本，采用Micro-CT扫描观察缺损区域的软骨下骨重建情况。<br>　　6.对敲低或过表达目标lncRNA慢病毒感染MSCs进行转录组学测序分析，筛选出差异表达基因，对差异表达基因进行GO富集分析和KEGG Pathway分析，然后通过RT-qPCR实验检测敲低或过表达目标lncRNA慢病毒感染MSCs中待选信号通路显著差异基因的表达，筛选出关键信号通路，采用Western Bloting验证关键信号通路的关键靶点蛋白。<br>　　7.构建KOA小鼠模型，关节康片干预后，采用RT-qPCR实验检测目标lncRNA和SOX9在KOA小鼠膝关节软骨中的表达，通过免疫组化研究关节康片干预对关键信号通路下游关键靶点蛋白表达的影响。<br>　　结果:<br>　　1.经生物信息学分析筛选得到一个位于SOX9反义链附近的目标lncRNA—LINC01152。<br>　　2.临床研究共纳入50例KOA患者（50对关节软骨标本），患者平均年龄为68.30±6.33 岁，其中女性 42 例（84％），男性 8 例（16％）;平均 BMI 为 26.37±3.78 kg/m2;左侧TKA26例（52％），右侧TKA24例（48％）;术前膝关节内翻畸形47例（94％），膝关节外翻畸形3例（6％）;Kellgren-Lawrence影像学分级Ⅳ级46例（92％），Ⅲ级4 例（8％）;Outbridge 分级Ⅳ级 44 例（88％），Ⅲ级 4 例（8％）,Ⅱ级 2 例（4％）。SOX9在KOA患者膝关节软骨OA组中表达明显下调（P＜0.001），而LINC01152表达明显上调（P＜0.001）。LINC01152和SOX9在KOA患者膝关节软骨OA组表达呈显著负相关性[rs=-0.4673，95％CI（-0.6646,-0.2091），P=0.0006]。在性别、年龄、BMI、手术侧别、膝关节冠状面畸形类型、K-L分级、Outbridge分级、ESR、CRP、UA等临床因素中，BMI与LINC00152在KOA患者膝关节软骨OA组中的表达呈正相关[β=0.353,95％CI（0.010,0.697）,P=0.044）]。<br>　　3.LINC01152和SOX9在细胞核和细胞质内均有表达，但二者主要在细胞质内表达（P＜0.01，P＜0.001）。LINC01152在MSCs体外培养诱导成软骨分化的第14天的表达明显下调（D14 vs D0，P＜0.001），而SOX9的表达则明显上调（D14vsD0，P＜0.001），两者存在显著的负相关性[r=-0.7760,95％CI（-0.9046,-0.5177），P＜0.0001]。<br>　　4.感染敲低LINC01152慢病毒和过表达LINC01152慢病毒组MSCs中LINC01152的表达明显下调（P=0.000）和上调（P=0.000）。感染敲低LINC01152慢病毒和过表达LINC01152慢病毒组MSCs中SOX9的表达明显上调（P=0.000）和下调（P=0.000）。这些结果证实，LINC01152对SOX9存在反式调控作用。敲低LINC01152导致 MSCs 中软骨相关基因 SOX5、SOX6、COL9A1、COL2A1、COMP 和 aggrecan的表达均呈现明显上调（P=0.000,P=0.018,P=0.012,P=0.001，P=0.006,P=0.000）,而过表达LINC01152则引起这些软骨相关基因表达下调（P=0.006,P=0.001，P=0.019,P=0.013,P=0.030,P=0.017）,表明 LINC01152 调控了 MSCs 成软骨分化过程。敲低LINC01152慢病毒感染后MSCs分化软骨细胞Alcian blue染色蓝色和Safranine O染色红色均明显变深;而过表达LINC01152慢病毒感染后MSCs分化软骨细胞Alcian blue染色蓝色和Safranine O染色红色均明显变浅，表明敲低LINC01152可促进MSCs成软骨分化，而过表达LINC01152可抑制MSCs成软骨分化。<br>　　5.Micro-CT扫描结果显示，与shNC组相比，sh-LINC01152组裸鼠膝关节缺损区域的骨体积分数（BV/TV）、骨密度（BMD）和骨小梁数量（Tb.N）显著增大（P＜0.05）,而骨小梁分离度（Tb.Sq）显著减小（P＜0.05）。VitroGel水凝胶-敲低LINC01152慢病毒感染MSCs混合物注射显着改善了缺损区域的软骨下骨重建。<br>　　6.转录组学测序分析结果显示，sh-LINC01152组和shNC组共筛选出与软骨相关的差异表达基因共262个，其中上调基因169个，下调基因93个。GO富集分析结果显示在生物学过程版块中，差异表达基因主要体现在细胞因子介导的信号通路、炎症反应和细胞对脂多糖的反应等方面。KEGG Pathway分析结果显示富集差异基因的Pathway主要分布在环境信息处理版块中，其中排名前6的Pathway为TNF信号通路、NF-kappa B信号通路、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用通路、TGF-β信号通路、细胞因子受体相互作用通路和MAPK信号通路。经RT-qPCR检测待选信号通路差异基因的表达，明确NF-kappa B信号通路是关键信号通路。Western Bloting验证显示敲低LINC01152慢病毒感染MSCs中p-p65、p65、p-IKKα/β、p-IKBβ的表达量显著降低，IKBβ表达量显著升高，而IKKβ和IKKα表达无明显变化。<br>　　7.关节康片干预可明显下调KOA小鼠膝关节软骨中LINCO1152的表达，并上调SOX9的表达(P＜0.001)。免疫组化结果显示，关节康片干预后KOA小鼠膝关节软骨组织中的p65表达显著降低，且药物浓度越高，降低程度越明显。<br>　　结论:<br>　　1.LINC01152可反式调控SOX9的表达，并抑制MSCs的成软骨分化;原位注射稳定敲低LINC01152的MSCs对裸鼠膝关节软骨缺损具有修复作用。<br>　　2.关节康片干预通过下调LINC01152表达抑制了 NF-kappa B信号通路下游信号p65、IKKα/β和p-IKBβ的磷酸化进而抑制该信号通路的激活起到改善OA的作用。