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摘要目的:<br>　　淫羊藿苷可缓解去势骨质疏松动物模型中的骨量丢失，但是其机制尚不完全清晰。本研究从动物、细胞和分子水平解析淫羊藿苷缓解去势骨质疏松动物模型中的骨量丢失的分子机制。本研究认为去势骨质疏松小鼠来源的BMSCs成骨分化能力的下降与其胞内AMPK/mTOR/自噬信号通路的异常相关，而淫羊藿苷可通过上调AMPK的磷酸化水平，进而抑制mTOR的磷酸化水平，促进BMSCs自噬水平，从而促进BMSCs的成骨分化，抑制其成脂分化，起到提高去势骨质疏松小鼠骨量的作用。同时，本研究采集健康人和绝经后骨质疏松症患者的骨髓间充质干细胞标本，明确淫羊藿苷可通过调控AMPK-mTOR-自噬信号通路促进绝经后骨质疏松症患者BMSCs的成骨分化潜能，为淫羊藿苷治疗绝经后骨质疏松症的临床应用提供一定的理论依据。<br>　　方法:<br>　　1.淫羊藿苷对去势骨质疏松小鼠模型骨组织内骨量和脂肪含量以及体外BMSCs成骨-成脂分化潜能的影响<br>　　12周龄C57BL/6雌性小鼠随机分为假手术组（CTR组）、去势组（OA组）、去势+淫羊藿苷组（OA+Ica组），每组10只。小鼠切除卵巢构建去势小鼠模型。去势3个月后，去势组及假手术组采用等量生理盐水灌胃;去势+淫羊藿苷组采用淫羊藿苷溶液灌胃。淫羊藿苷干预8周后取小鼠骨组织，分别采用Micro-CT、Calcein-AlizarinComplexon双标实验、HE染色等检测骨组织骨量变化及脂肪含量的变化;之后获取假手术组、去势组、去势+淫羊藿苷组小鼠的BMSCs，探究BMSCs体外的成骨和成脂分化潜能:①体外成骨诱导分化7天，检测碱性磷酸酶染色和定量、成骨分化相关基因和蛋白的表达情况;②成骨诱导分化14天，茜素红染色检测矿化结节的形成;③成脂诱导分化5天，油红O染色检测脂滴的形成，荧光定量PCR和WesternBlot检测成脂指标。<br>　　2.淫羊藿苷通过调控AMPK-mTOR-自噬信号通路影响去势小鼠来源BMSCs的成骨-成脂分化<br>　　（1）淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞成骨分化转录组的影响:获取假手术组、去势组、去势+淫羊藿苷组小鼠的BMSCs，RNA-seq分析淫羊藿苷对BMSCs成骨分化过程中转录组的影响;<br>　　（2）在BMSCs中，淫羊藿苷通过调控mTOR-自噬信号调控成骨和成脂分化:获取假手术组、去势组、去势+淫羊藿苷组小鼠的BMSCs，体外成骨诱导分化后提取蛋白，WesternBlot检测mTOR的磷酸化水平及自噬关键蛋白P62及LC3Ⅱ的表达情况。之后，采用mTOR的激活剂3-MA处理去势+淫羊藿苷组小鼠来源的BMSCs,并对其进行成骨和成脂的诱导分化，探明mTOR活性的调控是否影响了淫羊藿苷对BMSCs成骨和成脂分化潜能。<br>　　（3）骨组织中，淫羊藿苷对mTOR-自噬信号通路的影响:假手术组、去势组、去势+淫羊藿苷组中的小鼠处死后，固定骨组织，石蜡包埋，切片。免疫组化染色检测上述三组小鼠骨组织中mTOR的磷酸化水平、P62和LC3的表达。假手术组、去势组、去势+淫羊藿苷组中的小鼠处死后，液氮研磨小鼠的骨组织，加入蛋白裂解液收集骨组织的蛋白，WB检测骨组织中mTOR的磷酸化水平和P62、LC3的表达水平。<br>　　（4）淫羊藿苷通过调控AMPK/TSCs/mTOR信号通路影响BMSCs成骨分化过程中的自噬水平:在体内，获取假手术组、去势组、去势+淫羊藿苷组小鼠固定的骨组织，免疫组化染色检测p-AMPK的表达;研磨并收集上述小鼠的骨组织蛋白，WB检测AMPK、TSC2的磷酸化水平。在体外，获取假手术组、去势组、去势+淫羊藿苷组小鼠的BMSCs,WesternBlot检测AMPK、TSCs的磷酸化水平;并采用AMPK活性抑制剂Dorsomorphin处理去势+淫羊藿苷组小鼠来源的BMSCs,进而检测下游的mTOR磷酸化和P62、LC3Ⅱ的表达水平，探究淫羊藿苷是否通过促进AMPK的活性促进BMSCs成骨分化过程中的自噬水平。<br>　　3.淫羊藿苷调控AMPK-mTOR信号通路对绝经后骨质疏松症患者BMSCs自噬及成骨-成脂的影响<br>　　从研究者所在单位住院患者中存在干骺端或椎体骨折需手术治疗的患者中招募健康和绝经后骨质疏松症的女性患者各10例，在行骨折手术时同时从干骺端术中采取其骨髓样本2-3ml。从中提取骨髓间充质干细胞，通过成骨和成脂分化指标的检测分析，相较于正常人，绝经后骨质疏松症来源的BMSCs是否存在成骨和成脂分化潜能的差异。再对其进行Ica药物干预后，对成骨分化指标、AMPK、TSCs、mTOR的磷酸化水平及自噬水平（p62、LC3表征）进行检测分析。<br>　　结果:<br>　　1.体内，淫羊藿苷可缓解去势造成的小鼠骨量降低，骨脂增加:我们分别采用Micro-CT和HE检测假手术组，去势组，去势+淫羊藿苷小鼠中骨量和骨脂的变化，发现去势明显降低了小鼠的骨量，促进了骨脂的形成，而淫羊藿苷的干预则可逆转这一骨量减少，骨脂增加的趋势。而Calcein-AlizarinComplexon双标实验结果表明，淫羊藿苷通过促进新骨形成挽救去势造成的骨量丢失。<br>　　2.体外，淫羊藿苷可促进BMSCs的成骨分化潜能，抑制其成脂分化潜能:从小鼠（假手术组，去势组，去势+淫羊藿苷组）体内提取骨髓间充质干细胞，在体外进行成骨和成脂的诱导分化。碱性磷酸酶染色、定量;茜素红染色、定量;成骨特异性基因和蛋白的检测结果表明相较于假手术组，去势组的小鼠提取的骨髓间充质干细胞的成骨分化能力明显降低;油红O染色、定量，成脂特异性基因和蛋白的结果则表明发现去势组成脂分化能力明显增加;而去势+淫羊藿苷组的干预缓解了去势后引起的BMSCs成骨分化能力降低和成脂分化潜能的增加。<br>　　3.淫羊藿苷对BMSCs成骨分化过程中转录组的影响:从小鼠（去势组，去势+淫羊藿苷组）体内提取骨髓间充质干细胞，在体外进行成骨诱导分化7天后进行RNA-seq的分析。结果发现淫羊藿苷处理后，成骨细胞中自噬和mTOR信号通路发生了明显的变化。之后，WB检测结果也证实，淫羊藿苷的处理抑制了mTOR的磷酸化水平，促进了成骨细胞的自噬水平。采用mTOR的激动剂3-MA处理结果表明，淫羊藿苷通过抑制mTOR的磷酸化水平促进细胞自噬，进而调控间充质干细胞成骨、成脂的转换。<br>　　4.淫羊藿苷通过上调AMPK活性促进BMSCs中的自噬信号，进而促进其成骨分化:为探究淫羊藿苷如何调控BMSCs成骨分化中的mTOR/自噬信号，本研究对mTOR的上游信号通路AMPK/TSCs进行了检测，结果发现，淫羊藿苷促进了AMPK、TSCs的磷酸化水平;采用AMPK的活性抑制剂Dorsomorphin处理后发现，Ica对mTOR活性的抑制和自噬的促进被拮抗，上述结果表明，淫羊藿苷通过促进AMPK/TSCs的活化抑制了mTOR的磷酸化，进而促进了BMSCs成骨过程中的自噬水平。<br>　　5.绝经后骨质疏松症患者BMSCs中，淫羊藿苷通过调控AMPK-mTOR信号通路促进其自噬水平，进而促进其成骨分化:本研究分别收集了10例健康人和10例绝经后骨质疏松症患者的BMSCs,进行碱性磷酸酶染色、定量;茜素红染色、定量检测;油红O染色、定量及成骨成脂、特异性基因和蛋白的检测。结果表明与正常患者相比，骨质疏松症病人BMSCs的成骨分化降低，成脂分化增加;采用患者的样本进行淫羊藿苷的药物调控作用:淫羊藿苷促进了绝经后骨质疏松症患者来源的BMSCs的成骨分化。之后我们对AMPK/mTOR/自噬信号通路相关蛋白的磷酸化或表达水平进行了检测，结果表明，在绝经后骨质疏松症患者来源的BMSCs中，淫羊藿苷也上调了其AMPK的磷酸化水平，抑制了mTOR磷酸化，进而促进了其自噬水平。<br>　　结论:<br>　　小鼠去势后会干扰BMSCs中的AMPK-mTOR信号通路，导致其自噬水平下降，进而引起BMSCs成脂—成骨分化失衡，造成BMSCs成骨分化能力下降，引起骨量流失，成脂分化能力增强，进一步降低了骨骼强度;淫羊藿苷可通过激活AMPK信号通路，进而调控mTOR的磷酸化水平，促进BMSCs中的自噬水平。临床样本也发现淫羊藿苷促进了AMPK信号，抑制了mTOR活性，促进了自噬。综上所述，我们由此推断淫羊藿苷可能通过调控AMPK/mTOR/自噬信号影响BMSCs的成骨—成脂分化潜能转换，由此起到治疗绝经后骨质疏松症的作用。