检索历史 清除

摘要缺血性卒中发病率、致死致残率较高，且呈现年轻化趋势，给社会及家庭带来了沉重的经济负担。缺血性卒中临床救治棘手，在血管开通后发生再灌注损伤，相关研究表明，细胞凋亡是其中一个重要的调节机制，西医救治疗效仍有待提高。中医认为中风是本虚标实的疾病，气虚血瘀是其重要的病机，针对该病机，古人确立了益气活血治疗大法，课题组选取了临床应用广泛的黄芪注射液及川芎嗪注射液进行组方联用，发挥益气活血作用，前期研究证实芎芪合剂（黄芪注射液联用川芎嗪注射液）可以减轻兴奋性氨基酸的毒性、减轻神经炎症反应、调节血脑屏障通透性等作用。本文从调控细胞凋亡的角度进行研究为进一步探究芎芪合剂发挥作用的途径，并进行了调控机制的研究。<br>　　目的:<br>　　1.通过体内构建大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型及体外构建细胞氧糖剥夺/再复氧复糖模型来研究芎芪合剂对相关凋亡因子、氧化应激、线粒体膜电位等指标的影响，探讨芎芪合剂对脑缺血再灌注损伤的作用及可能的机制;<br>　　2.通过生信分析及转录组测序进一步寻找差异表达基因及信号，进一步研究芎芪合剂调控细胞凋亡发挥作用的可能通路及机制。<br>　　方法:<br>　　1.采用大鼠构建大脑中动脉缺血再灌注损伤模型，分组为假手术组、模型组、模型+黄芪组、模型+川芎组、模型+芎芪合剂组，采用行为学评分及TTC染色评价动物模型构建情况及病理改变，通过HE染色及尼氏染色观察梗死区神经细胞病理变化情况;通过免疫组化观察各组大鼠相关凋亡因子表达情况;采用蛋白免疫印迹及实时荧光定量PCR方法检测各组大鼠相关凋亡因子蛋白及mRNA表达情况。<br>　　2.采用PC12细胞构建氧糖剥夺/再复氧复糖模型，分为CONTROL组、OGD/R组、OGD/R+黄芪组、OGD/R+川芎嗪组及OGD/R+芎芪合剂组，通过MTT确定黄芪注射液、川芎嗪注射液及芎芪合剂的安全药物浓度及有效药物浓度，通过检测活性氧检测试剂盒及线粒体膜电位试剂盒检测各组细胞活性氧水平及线粒体膜电位变化情况，通过AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒来检测各组细胞凋亡情况。<br>　　3.为进一步研究芎芪合剂调控细胞凋亡机制，通过GEO数据库寻找相关芯片，应用R软件（4.0.1版）limma包标准化数据及筛选差异基因，运用R语言ggpubr和pheatmap包对差异基因绘制火山图和热图，并使用ggplot2包绘制差异基因和转录基因的韦恩图，筛选出差异表达的转录因子;<br>　　4.利用慢病毒载体在PC12细胞上敲低转录因子，并利用嘌呤霉素筛选出稳转株，采用蛋白免疫印迹进行敲低效果验证;在此基础上进行转录组差异测序，筛选出靶基因及相关通路，并对芎芪合剂作用及通路进行功能验证。<br>　　结果:<br>　　1.通过在体构建经典的大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型来进行芎芪合剂的药效评估，造模成功后，大鼠会出现神经功能缺损症状，模型组及给药组大鼠术后饮食明显减少，频率下降，精神萎靡，喜蜷缩，呈弓背状，对外界刺激反应迟钝，活动时出现站立不稳，向偏瘫一侧跌倒或转圈，提起鼠尾时可见大鼠患侧前肢屈曲;大鼠神经功能缺损症状，且模型评判的金标准均已证实模型的成功，通过统计分析也证实了芎芪合剂组大鼠神经功能缺损症状有所下降，芎芪合剂组同模型组比较(P＜0.05）,差异有统计学意义，假手术组未见梗塞，同模型组相比，梗塞体积具有统计学意义（P＜0.01），其中芎芪合剂组梗塞体积同模型组相比，（P＜0.05），差异有统计学意义。<br>　　2.免疫组化检测大鼠缺血半暗带区域相关凋亡因子表达情况，结果显示:与正常组比较，模型组bax、caspase3、caspase9等蛋白表达显著上调（P＜0.05），抑凋亡蛋白bcl-2表达显著下调（P＜0.05）;予药物处理后，与模型组相比，模型+黄芪组、模型+川芎嗪组、模型+芎芪合剂组bax、caspase3、caspase3均有所下调，具有统计学意义（P＜0.05）,bcl-2表达均上调（P＜0.05）,且模型+芎芪合剂组同模型+黄芪组、模型+川芎嗪组，相关指标具有统计学差异（P＜0.05）,蛋白免疫印迹及实时荧光定量PCR检测bax、caspase3、caspase9、bcl-2的表达情况基本一致。<br>　　3.MTT确定黄芪注射液及川芎嗪注射液以及芎芪合剂的安全药物浓度，在黄芪注射液中，当黄芪注射液浓度为100mg/μl,跟正常组细胞相比，细胞成活率显著下降（P＜0.001）;在川芎嗪注射液中，当浓度为800ng/μl时，跟正常组细胞相比，细胞成活率显著下降（P＜0.0001）,提示浓度达到800ng/μl,细胞开始出现损伤。在芎芪合剂中，当浓度为40mg/μl+400ng/μl细胞成活率显著下降（P＜0.0001），差异具有统计学意义。<br>　　4.MTT确定黄芪注射液及川芎嗪注射液以及芎芪合剂的有效药物浓度，各组细胞经过OGD/R处理后，在黄芪注射液中，当浓度达到60mg/μl时，同对照组细胞相比（P＜0.05）;在川芎嗪注射液中，当浓度达到300ng/μl,同对照组细胞相比（P＜0.05）;在芎芪合剂中，当浓度达到60mg/μl+200ng/μl（P＜0.0001），差异具有统计学意义。<br>　　5.各组细胞活性氧水平检测结果显示，造模处理后，OGD/R组活性氧表达增加，给药处理后，同OGD/R组相比，OGD/R+黄芪组、OGD/R+川芎嗪组及OGD/R+芎芪合剂组活性氧水平均有所下降（P＜0.05）;其中同OGD/R+黄芪组及OGD/R+川芎嗪组相比，OGD/R+芎芪合剂活性氧水平下降更为明显（P＜0.05），差异具有统计学意义。<br>　　6.各组细胞线粒体膜电位检测结果显示，造模处理后，OGD/R组细胞线粒体膜电位下降，给药处理后，同OGD/R组相比，OGD/R+黄芪组、OGD/R+川芎嗪组及OGD/R+芎芪合剂组活性氧水平均有所上升（P＜0.05），其中同OGD/R+黄芪组及OGD/R+川芎嗪组相比，OGD/R+芎芪合剂活性氧水平上升更为明显（P＜0.05），差异具有统计学意义。<br>　　7.流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，同OGD/R组相比，CONTROL组、OGD/R+黄芪组、OGD/R+川芎嗪组及OGD/R+芎芪合剂组均有所下降，具有统计学差异（P＜0.05），同OGD/R+黄芪组相比及OGD/R+川芎嗪组相比，OGD/R+芎芪合剂组（P＜0.05），均具有统计学意义。<br>　　8.利用GEO下载获得正常组及大鼠大脑中动脉缺血的动物模型差异基因数据集，编号为GSE97537,应用limma包对数据集进行数据矫正及差异分析，以校正后P＜0.05为阈值获得了6009个差异基因，包括3210个上调基因及2799个下调基因。应用pheatmap包绘制出所有差异基因的表达热图。应用ggplot2包绘制出差异基因和转录因子基因的韦恩图，获得了16个差异的转录因子（Stat3,Cebpb,Myc,Cebpz,Nfkb1,Nr3c1,Jun,Stat6,Fastk,Ets1,Irf1,Fabp4,Yy1,Sp1,Stat1,Satb1），通过分析结果，查阅相关文献，确定转录因子YY1作为研究对象。<br>　　9.通过构建慢病毒载体完成PC12细胞的转录因子YY1的敲低，并通过嘌呤霉素进行稳转株筛选，可获得稳定表达，通过倒置显微镜记录嘌呤霉素筛选过程，通过蛋白免疫印迹方法进行效果验证，结果显示敲低组通各组相比，P＜0.0001,差异具有统计学意义。<br>　　10.转录组测序，基于比对结果，进行可变剪接预测分析、基因结构优化分析以及新基因的发掘，发掘新基因3,490个，其中941个得到功能注释。获得差异表达基因列表、差异表达基因功能富集分析中进行靶点及通路验证。<br>　　结论:<br>　　1.体内实验中，我们发现黄芪注射液联用川芎嗪注射液可改善MCAO大鼠的行为学评分，减少MCAO大鼠脑组织的梗塞体积，可以下调Bax、Caspase3、Caspase9的表达，上调抗凋亡因子Bcl-2的水平，说明芎芪合剂可通过减少细胞凋亡来发挥神经保护作用，减轻脑损伤程度;<br>　　2.体外实验中，通过构建了PC12细胞氧糖剥夺/再复氧复糖的细胞模型，确定出了安全药物浓度及有效药物浓度，同时可以减少活性氧的生成，维持线粒体膜电位的稳定，可以减轻细胞凋亡的程度，说明芎芪合剂在体外同样可以发挥神经保护作用;<br>　　3.通过生信分析及转录组测序选择转录因子YY1作为研究对象，通过慢病毒载体构建敲低YY1基因的稳转株细胞，通过转录组测序，结合验证结果，发现芎芪合剂可能通过YY1/MAPK通路来发挥相关抗凋亡作用。