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摘要研究背景<br>　　心肌缺血再灌注(IR)损伤是心肌梗死患者接受冠脉开通治疗的重要并发症之一。基础研究发现心肌IR损伤的防治措施主要有缺血预适应、缺血后处理、氧自由基清除剂、pH纠正和钙拮抗剂等，但是这些措施均未获得肯定的临床效果，亟需寻找新的治疗靶点。本课题组前期研究发现了心肌肥厚预适应现象(HP)，即短期肥厚刺激(3-7天)可增强心脏抵抗后续持续的肥厚刺激的能力，延缓心衰进程。在此基础上有文献报道这种短期HP可改善心肌IR损伤。但目前关于HP的基础研究仅局限于一周以内的短期肥厚刺激，而临床上很多病人是在经历较长时间压力刺激后才解除压力负荷的，比如不少主动脉狭窄或高血压患者很晚才开始换瓣或降压治疗。非短期肥厚刺激，如果在刺激解除后，肥厚完全消退，是否也具有抗病理性心肌肥厚的作用？若有，其机制为何？这些问题目前尚无答案。我们通过预实验发现，非短期HP能够改善心肌IR损伤和心肌能量代谢，且能量代谢关键酶-丙酮酸脱氢酶激酶4(Pdk4)表达下调，提示Pdk4可能参与非短期HP抵抗心肌IR损伤，具体机制有待探索。<br>　　本课题拟探究非短期HP产生的代谢记忆分子Pdk4发挥心脏保护效应的作用及机制。<br>　　研究方法<br>　　1、构建非短期HP模型<br>　　利用可吸收缝合线对C57BL/6雄性小鼠行主动脉弓缩窄术（TAC），术后1周彩色多普勒检测小鼠主动脉弓缩窄处的血流速度，以3000mm/s为筛选条件（可吸收线2周吸收，肥厚刺激自动解除），超声确认TAC2周左室室壁厚度是否明显增加，结扎线吸收2周后心肌肥厚是否完全消退。<br>　　2、小鼠心肌IR模型<br>　　甲苯噻嗪（5mg/kg）和氯胺酮（100mg/kg）混合麻醉剂麻醉小鼠后，连接呼吸机，开胸暴露心脏。对小鼠冠脉左前降支进行活结结扎，结扎45分钟后解开活结进行再灌注24小时。<br>　　3、IR后梗死面积测定<br>　　如前所述将小鼠麻醉并连接呼吸机，开胸后止血钳固定胸壁，暴露心脏，分离胸腺暴露主动脉。使用8-0缝合线对左冠状动脉进行原位结扎，动脉夹夹闭主动脉，在主动脉内注射1.0％Evansblue染液，注入5秒后取心脏清洗并冷冻。将心脏均匀切成5片，放入1％TTC染液37℃孵育染色30min,4％多聚甲醛固定后拍照。分析小鼠心脏的左室区（LV）、梗死区（IA）和危险区（AAR）面积进行定量分析。<br>　　4、筛选差异表达基因<br>　　对假手术组和HP组小鼠心脏组织进行mRNA测序（每组n=3）,并利用生物信息软件GO和KEGG进行功能聚类富集分析和作用通路分析，以|log2FC|≥1.2,FDR＜0.05为筛选条件筛选两组之间的差异表达基因。<br>　　5、超声心动图检测<br>　　利用超高分辨率小动物成像系统Vevo2100行超声心动图检测小鼠左心室游离壁厚度（LVAW）、左心室内径（LVID）、左心室射血分数（EF）、左心室短轴缩短率（FS）等，行彩色多普勒检测小鼠主动脉弓缩窄处血流速度。<br>　　6、小鼠组织学及分子生物学检测<br>　　处死小鼠并取材，测量体重（BW）、心脏重量（HW）、胫骨长度（TL）等。固定心脏组织，拍摄保存心脏大体照并分别行苏木素-伊红（HE）、麦胚凝集素（WGA）染色、Masson染色、Tunel染色。q-PCR检测纤维化标记物Ⅰ型胶原蛋白α1（Col1α1）、Ⅲ型胶原蛋白α1（Col3α1）和心肌肥厚标记物心房钠尿肽前体A（Nppa）、肌球蛋白重链7（Myh7）的表达水平。免疫印迹检查基因敲除效果和凋亡相关蛋白表达。<br>　　7、心脏特异性Pdk4敲除小鼠构建<br>　　配制浓度为10mg/ml他莫西酚无菌玉米油溶液，向8-10周龄的Pdk4条件敲除小鼠（Pdk4-CKO）和野生对照组（Myh6-creER）小鼠隔天腹腔注射他莫西酚溶液（0.5mg/只），共注射3针。注射完最后一针后，休息4周再进行下一步实验。<br>　　8、腺病毒（Ad）左心室心肌内转染过表达Pdk4<br>　　如前所述将小鼠麻醉并连接呼吸机，在小鼠胸骨左缘第5肋间进入胸腔，暴露左心室，对小鼠左心室三点原位注射Ad病毒（左心室心尖部、左心室壁前壁和左心室壁后壁，10μL/点），注射后2-3天进行下一步实验。<br>　　研究结果<br>　　1、非短期HP模型的验证<br>　　通过超声心动图检测发现，可吸收线在缩窄主动脉弓后2周完全吸收（多普勒超声显示跨狭窄部压力阶差消失），此时心脏处于肥厚阶段，室壁厚度、HW/BW和心肌纤维化明显高于sham组，随后心肌肥厚逐渐消退，4周时恢复至基线水平:心脏大小、心肌细胞面积、心肌纤维化及心肌肥厚标记基因、纤维化标记基因均恢复基线水平。这些结果提示非短期HP模型构建成功。<br>　　2、非短期HP减轻心肌IR损伤<br>　　心肌缺血45min再灌注24h后，HP组的心肌梗死面积、心肌细胞凋亡率、心肌纤维化面积明显低于无HP的对照组，而LVFS和LVEF则高于对照组。<br>　　3、代谢记忆分子Pdk4是非短期肥厚预适应中明显下调的基因<br>　　通过对非短期HP及假手术小鼠进行mRNA转录组测序分析显示，Pdk4基因在HP组显著下调，两组之间的|log2FC|=1.4090,FDR=0.0091;通过GO分析发现，差异基因主要富集于代谢相关过程。<br>　　4、心脏特异性敲除Pdk4改善心肌IR损伤<br>　　对他莫西酚诱导心脏特异性敲除Pdk4小鼠及Myh6-creER小鼠行IR手术，再灌注24小时后，组织学染色提示，Pdk4敲除可以显著减少IR后心肌梗死面积和心肌细胞凋亡。<br>　　5、腺病毒（Ad）过表达Pdk4加重心肌IR损伤<br>　　对腺病毒（Ad）过表达Pdk4的小鼠及对照组行IR手术，组织学染色显示，Pdk4过表达显著增加IR损伤后的心肌梗死面积和心肌细胞凋亡。<br>　　研究结论<br>　　非短期肥厚预适应通过下调Pdk4抑制心肌细胞凋亡从而改善心肌缺血再灌注损伤。