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摘要LuxI/R系统是费氏弧菌（Vibrio fisheri）中的一种群体感应系统。LuxI/R系统介导重组蛋白在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中自诱导胞外表达，因可缓解菌体生长与产物合成间的矛盾、无需外源诱导剂以及避免了用于蛋白表达的自诱导因子对宿主菌其它生理活动的干扰等优点，对规模化发酵生产食品酶等工业酶具有重要意义。然而，目前LuxI/R系统在枯草芽孢杆菌中的自诱导表达强度低，限制了其在枯草芽孢杆菌中自诱导高效胞外表达重组蛋白中的应用。<br>　　针对上述问题，本课题拟通过LuxI/R系统中诱导模块和响应模块的启动子优化提高其在枯草芽孢杆菌中的自诱导表达强度。首先，在枯草芽孢杆菌中构建LuxI/R介导的自诱导蛋白胞外表达系统。然后，分别通过对诱导模块和响应模块启动子的-10区和-35区核心区以及UP区和Spacer区关键区进行理性或非理性改造，提高LuxI/R系统在枯草芽孢杆菌中的自诱导表达强度。本论文的主要研究结果如下:<br>　　1、构建了 LuxI/R介导的枯草芽孢杆菌自诱导蛋白胞外表达系统。基于V.fisheri中的LuxI/R系统，以生淀粉α-淀粉酶AmyZ1为报告蛋白，以B.subtilis WB600为表达宿主，构建了枯草芽孢杆菌自诱导蛋白胞外表达系统。结果发现，LuxI/R系统可介导AmyZ1在枯草芽孢杆菌中实现自诱导胞外表达，获得的胞外AmyZ1活性为115 U/mL,但低于Pveg介导的胞外AmyZ1活性（130 U/mL）。进一步基于两种新报告蛋白，验证了 LuxI/R介导的枯草芽孢杆菌自诱导蛋白胞外表达系统的普适性。<br>　　2、通过优化诱导模块启动子的-10区和-35区，提高了 LuxI/R系统在枯草芽孢杆菌中的自诱导表达强度。基于枯草芽孢杆菌表达系统已有的强启动子，对诱导模块启动子PluxR和PluxI的-10区和-35区进行理性改造。结果发现，分别替换P43的-10区和PspoVG的-35区序列，获得的突变体PluxI-4310和PluxI-spoVG35介导的胞外AmyZ1活性分别为对照PluxI的1.26和1.4倍。进一步构建的双突变体PluxI-4310spo35介导的胞外AmyZ1活性为210 U/mL,是对照PluxI的1.83倍。经qRT-PCR和DNA二级结构自由能分析可知，PluxI-4310spo35的表达效果与其转录强度以及DNA二级结构稳定性呈现线性关系。<br>　　3、通过优化诱导模块启动子PluxI的UP区和Spacer区，进一步提高了 LuxI/R系统在枯草芽孢杆菌中的自诱导表达强度。通过对PluxI-4310spo35的UP区和Spacer区序列进行半理性改造，获得的突变体PluxI-IUP3-4310spo35和PluxI-4310-SpacerI-spo35介导的胞外AmyZ1活性为295和289U/mL,分别是初始PluxI的2.57和2.52倍。然而，在此基础上构建的双突变体PluxI-IUP3-4310-SpacerI-spo35介导的胞外AmyZ1活性仅为135 U/mL。基于自由能分析结果可知，DNA二级结构稳定性降低是PluxI-IUP3-4310-spacerI-spo35呈现负效果的重要原因。<br>　　4、通过优化响应模块启动子PluxI的-10区和-35区以及LRB位点，实现了 LuxI/R系统在枯草芽孢杆菌中的自诱导高效表达。首先，对响应模块中PluxI的-10区和-35区进行理性改造和非理性突变。结果发现，PluxI的-35区突变成TTACA序列后，获得的突变体PluxI-GA介导的胞外AmyZ1活性为216 U/mL,较野生型PluxI提高了 88%。进一步优化响应模块PluxI中LRB位点拷贝数，结果发现，含有双拷贝LRB位点的突变体PluxI-GA-dLRB可将重组菌胞外AmyZ1活性为提高至346 U/mL。基于自由能分析结果可知，PluxI-GA-dLRB的表达效果与其DNA二级结构稳定性呈线性关系。通过3-L罐扩大培养发酵，最终诱导模块PluxI-IUP3-4310-SpacerI-spo35与响应模块PluxI-GA-dLRB共同介导的重组菌胞外AmyZ1活性为5814.67 U/mL,是Pveg介导的重组菌（1892 U/mL）的3倍。<br>　　综上，本研究构建了枯草芽孢杆菌LuxI/R自诱导蛋白胞外表达系统，并通过诱导模块和响应模块的启动子优化，有效提高了 LuxI/R系统在枯草芽孢杆菌中的自诱导表达强度。本课题的开展可为基于LuxI/R系统枯草芽孢杆菌自诱导高效胞外表达重组蛋白提供理论基础，促进枯草芽孢杆菌自诱导蛋白胞外表达系统的发展。