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摘要目的：<br>　　1.阐明miR-122调控肝脏脂代谢、抗脂质过氧化的分子机制，揭示miR-122在维持肝脏正常生理功能中的作用，推进人们对铁过负荷导致肝脏病理改变机制的理解;<br>　　2.进一步明确miR-122调控分子网络在铁过负荷导致肝脏脂质过氧化损伤中的作用，预防非酒精性脂肪性肝病，开发非酒精性脂肪肝治疗新方法提供实验依据。<br>　　方法：<br>　　1、miR-122敲除及动物实验<br>　　通过CRISPR技术构建了miR-122敲除小鼠，采用8周龄成年雄性同窝miR-122+/+和miR-122-/-小鼠，分别设置对照饲料组和铁过负荷组（3％右旋糖酐铁），共四组，每组小鼠8-10只，喂食3个月后检测肝脏脂质代谢情况。<br>　　2、肝脏脂肪变性及脂质过氧化损伤检测<br>　　取部分小鼠肝组织于4％多聚甲醛中固定24h,做石蜡切片用于HE染色观察组织形态、普鲁士蓝染色观察肝脏铁状态、天狼星红染色观察肝脏纤维化情况，做冰冻切片用于油红染色观察肝脏脂肪蓄积情况、α-SMA免疫组化染色观察肝脏纤维化情况。<br>　　3、多组学研究<br>　　通过液相-质谱检测铁过负荷和miR-122敲除小鼠肝脏代谢产物变化，聚焦肝脏脂质代谢通路;通过转录组测序检测铁过负荷和miR-122敲除小鼠肝组织基因表达情况，聚类差异基因，分析铁过负荷和miR-122敲除导致肝脏脂肪变性和脂质过氧化的关键分子并进行验证;通过iTRAQ技术检测铁过负荷和miR-122敲除小鼠肝组织蛋白表达情况，聚类差异表达蛋白，与代谢组鉴定的代谢通路、转录组测序结果对比验证，并对关键分子表达进行验证。<br>　　4、脂肪酸检测<br>　　使用全自动水解脂肪测定仪提取小鼠肝组织总脂肪，旋转蒸发仪浓缩至干，残留物为脂肪提取物。提取的脂肪的经皂化和脂肪酸甲酯化后与37种脂肪酸甲酯标准品经气相色谱仪（岛津GC-2030）分离、以色谱峰峰面积定量，经标准品及内标换算后测得肝组织中各类脂肪酸的含量变化，确定富铁膳食及miR-122敲除导致脂质过氧化的主要不饱和脂肪酸底物和产物。<br>　　5、RNA表达检测<br>　　Trizol试剂提取小鼠肝组织和原代肝细胞总RNA,测定浓度并将各样本浓度稀释至相同，使用反转录试剂盒反转录得到cDNA模板。cDNA与水、引物、ROX Reference Dye、SYBR Green混合配置qPCR反应体系，进行扩增，根据Ct值采用2-△△CT法进行相对定量，检测脂质代谢酶AACS、AGPAT1、MOGAT2、SLC27A1、脂肪酸去饱和酶FADS2、氧化酶CYP2B9、CYP2A22、CYP3A11的RNA表达水平。<br>　　6、蛋白表达检测<br>　　使用加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取小鼠肝组织和原代肝细胞全蛋白，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度，将各样本浓度稀释至相同。加入蛋白上样缓冲液混匀，煮沸变性后得到检测样品。Western Blot蛋白免疫印迹法检测脂质代谢酶AACS、AGPAT1、MOGAT2、SLC27A1、脂肪酸去饱和酶FADS2、氧化酶CYP2B9、CYP2A22、CYP3A11的蛋白表达情况，天能全自动化学发光图像分析系统，获取图像，使用Image J软件进行灰度分析。<br>　　7、细胞实验<br>　　从细胞层面证实miR-122对下游分子的调控作用，提取miR-122+/+和miR-122-/-小鼠的原代肝细胞进行培养作为细胞模型，各自分为对照组、转铁蛋白干预组、miR-122agomir回补联合转铁蛋白干预组。在细胞中观察miR-122敲除、过表达及铁干预对靶基因mRNA表达和蛋白表达的影响，检测脂质含量、不饱和脂肪酸含量、过氧化脂肪酸产物的影响，进一步证实miR-122在铁影响肝脂代谢中的作用。<br>　　8、miR-122回补实验<br>　　通过动物实验进一步验证回补miR-122表达通过靶基因对铁过负荷引起的肝脏脂质过氧化损伤的影响作用。使用miR-122敲除小鼠及同窝野生型小鼠，共分为四组:（1）miR-122+/+小鼠+对照饲料;（2）miR-122-/-小鼠+对照饲料;（3）miR-122-/-小鼠+富铁饲料;（4）miR-122-/-小鼠+富铁饲料+miR-122agomir回补，每组小鼠5-7只。经尾静脉注射miR-122agomir作为回补实验分子，每月注射1次，在3个月的铁过负荷模型喂养周期中共注射3次。<br>　　结果：<br>　　1、miR-122敲除加重铁过负荷引起的肝脏脂质过氧化损伤<br>　　检测肝脏miR-122表达量，证实CRISPR技术构建miR-122敲除小鼠成功，且野生型小鼠喂食3％右旋糖酐铁饲料3个月后，miR-122表达量较对照组有所下降。铁过负荷组小鼠的肝脏铁含量、血清ALT和AST含量较对照组均有升高，而miR-122敲除联合铁过负荷组的上述指标升高更为明显。HE染色、油红染色、天狼星红染色和α-SMA免疫组化染色结果显示，铁过负荷组肝组织出现病理改变，联合组改变更为显著，提示肝损伤严重。铁过负荷组小鼠肝脏脂肪、甘油三脂含量、脂质过氧化物MDA和LPO含量均高于对照组，且联合组的指标升高更为显著。上述结果提示miR-122敲除与铁过负荷存在协同作用，即miR-122敲除加重铁过负荷引起的肝脏脂质过氧化损伤。<br>　　2、铁过负荷和miR-122影响多不饱和脂肪酸的合成和过氧化<br>　　代谢组学分析显示铁过负荷与miR-122敲除导致小鼠肝脏脂质代谢产物显著改变，富集差异代谢通路主要为脂肪酸生物合成与氧化。通过各组气相色谱图脂肪酸峰值计算分析，发现变化差异主要集中于多不饱和脂肪酸。miR-122敲除组的肝脏多不饱和脂肪酸在总脂肪酸中的占比升高，且miR-122敲除联合铁过负荷组升高更为明显。由此推测，miR-122可通过多不饱和脂肪酸的含量变化调控肝脏脂质代谢。<br>　　对蛋白组学及转录组学数据进行GO和KEGG交叉富集分析，结果显示主要的差异蛋白和基因种类集中于脂质代谢过程。<br>　　3、miR-122调控脂肪酸合成酶AACS和脂肪酸去饱和酶FADS2的表达影响多不饱和脂肪酸的合成和过氧化<br>　　细胞实验中，相比于单纯转铁蛋白干预组，miR-122敲除联合铁过负荷组的甘油三酯TG、脂质过氧化指标MDA和LPO含量都显著升高，miR-122agomir回补后较联合组的上述指标又明显下降，提示miR-122在铁过负荷引起肝脂代谢紊乱中具有调控作用。<br>　　运用Realtime-PCR技术检测各组间差异的脂质代谢相关基因的表达情况。相比于单纯铁过负荷组，AACS和FADS2在miR-122敲除联合铁过负荷组的表达水平均出现显著升高，且在回补miR-122表达后出现下降。其他脂质代谢相关基因在联合组的表达水平虽出现上升，但在回补后与联合组间未出现显著差异。进一步通过Western Blot法检测上述相关蛋白表达情况，相比于单纯铁过负荷组，AACS和FADS2蛋白在miR-122敲除联合铁过负荷组的表达量显著升高，且在miR-122agomir回补后出现下降。通过基因和蛋白的验证，说明miR-122可能通过调控脂质代谢中AACS和FADS2在铁过负荷引起的肝脏脂质过氧化损伤中起到保护作用。<br>　　双荧光素酶报告基因技术的结果显示，miR-122显著降低了野生型AACS和FADS2的荧光素酶活性，但对突变型AACS和FADS2荧光素酶活性没有影响。<br>　　4、恢复miR-122表达通过调控AACS、FADS2缓解铁过负荷引起的肝脏脂质过氧化损伤<br>　　动物实验中，miR-122agomir回补组的miR-122表达量显著升高，证实miR-122agomir回补表达有效。miR-122敲除联合铁过负荷组的血清ALT、AST含量较单纯铁过负荷组升高，且在miR-122agomir回补后下降，提示miR-122在铁过负荷引起肝损伤中具有调节作用。<br>　　进一步通过Realtime-PCR技术检测各组间差异的脂质代谢相关基因的表达情况。相比于miR-122敲除联合铁过负荷组，AACS和FADS2在miR-122agomir回补后的表达量显著下降，而其他脂质代谢相关基因在联合组和回补组间的表达量未出现显著差异。进一步通过WesternBlot法检测上述相关蛋白表达情况，同样AACS和FADS2在miR-122agomir回补组的表达量较联合组显著下降。通过基因和蛋白的多方面验证，证实了miR-122在调控肝脏脂质代谢过程中的重要作用，可通过下调AACS、FADS2影响脂质代谢，在铁过负荷引起的肝脏脂质过氧化损伤中起到保护作用。<br>　　结论：<br>　　本研究建立了铁过负荷、miR-122敲除/回补小鼠模型，观察了miR-122在铁过负荷导致肝脏脂质过氧化损伤中的影响作用，通过多组学分析探索铁过负荷通过miR-122导致脂质过氧化的分子机制，筛选出脂质代谢相关的靶基因，并在细胞实验和动物实验中进行验证，由此作为miR-122调控分子网络在铁过负荷导致肝脏脂质过氧化损伤中的机制的初步研究，主要结论如下:<br>　　1.铁过负荷引起的miR-122下调可加重其导致的肝脏脂质过氧化损伤;<br>　　2.铁过负荷与miR-122敲除导致脂肪酸合成和氧化相关酶表达显著改变，多不饱和脂肪酸及过氧化产物含量增多;<br>　　3.miR-122可通过下调靶基因AACS和FADS2的表达，从而缓解铁过负荷导致的脂质过氧化损伤。