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摘要放射性肠损伤(Radiation-inducedIntestinalInjury，RIII)是结直肠癌患者放射治疗最常见的并发症之一，其发病率高，不仅严重影响患者的生活质量，而且阻碍肿瘤的治疗进程，造成了巨大的卫生经济学负担。目前临床上针对RIII尚无特效治疗药物，因此，亟需寻找有效的RIII临床防治靶标。<br>　　研究目的<br>　　1、基于临床人组织样品，探究Creld2在人体不同组织器官的分布与表达。<br>　　2、通过人小肠类器官构建RIII模型，确认Creld2对临床RIII的防治作用。<br>　　3、探究Creld2对RIII的防治作用机制和相关信号通路。<br>　　4、在明确Creld2防治RIII的基础上，初步探究Creld2对结直肠癌肿瘤进程和预后的影响。<br>　　研究方法<br>　　1、使用免疫组化染色及实时荧光定量PCR检测临床人组织样品中Creld2的分布与表达情况;同时对收集的临床人肠道组织进行免疫荧光染色，观察Creld2与不同肠道细胞的共定位分布情况。<br>　　2、通过提取临床人小肠组织中的肠隐窝成体干细胞建立人小肠类器官培育平台，并以此构建RIII模型，并确定该模型的辐照剂量-损伤程度量效关系。在人小肠类器官RIII模型中，通过外源性给予Creld2重组蛋白和慢病毒转染介导Creld2内源性敲减及过表达，以辐照后小肠类器官表面积变化、DNA损伤标志物表达和乳酸脱氢酶释放为评价指标，明确Creld2对放射性肠损伤的防治作用。<br>　　3、在小肠类器官辐照后第1天和第3天，收集正常培养组、辐照组和Creld2重组蛋白治疗组样品。通过TUNEL染色及Ki67免疫组化染色检测不同组辐照后细胞凋亡和增殖情况。同时对上述组别的小肠类器官进行了转录组测序，通过进一步数据分析筛选差异表达的基因，并对这些基因进行富集分析。使用免疫印迹和实时荧光定量PCR技术检测Creld2重组蛋白治疗后内质网应激相关通路核心蛋白和mRNA的表达，探寻Creld2减轻辐照后损伤的调控机制。<br>　　4、基于TCGA数据库中结、直肠癌样品的转录组数据及临床信息，使用生物信息学技术对Creld2在结直肠癌中的表达及其对肿瘤预后的影响进行了相关性分析;并通过实时荧光定量PCR技术对临床收集的10例结直肠癌患者的肿瘤组织、癌旁组织和肠系膜脂肪中Creld2mRNA表达水平进行验证。同时，通过慢病毒转染HCT116细胞介导Creld2敲减和过表达，结合CCK-8和Transwell实验，检测Creld2表达水平对肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。<br>　　研究结果<br>　　1、Creld2在人体多种组织中均有不同程度的表达。在人回肠组织中，Creld2广泛分布于肠隐窝和绒毛结构内，且在两者中的表达无显著差异。免疫荧光染色显示，Creld2在肠道细胞内广泛分布，未发现Creld2与LGR5+肠干细胞、潘氏细胞、内分泌细胞和杯状细胞存在特异性共定位情况。<br>　　2、免疫荧光染色和实时荧光定量PCR技术检测证实人小肠类器官培育成功，且其主要的细胞组成为LGR5+肠干细胞。使用人小肠类器官制备RIII模型探究模型时效关系与治疗剂量关系，确认辐照剂量为20Gy、人Creld2重组蛋白剂量为3μg/mL。进一步探究Creld2对RIII的防治作用显示，无论是辐照前还是辐照后给予3μg/mLCreld2重组蛋白治疗、或通过内源性过表达Creld2,均可以改善辐照引起的小肠类器官表面积缩小，减少辐照后DNA损伤程度和细胞结构的破坏。而内源性敲减Creld2表达可抑制小肠类器官的正常生长。<br>　　3、免疫荧光染色及半定量分析显示，Creld2重组蛋白治疗减少RIII后细胞凋亡，促进细胞增殖。转录组测序差异基因GO富集分析显示，与辐照组相比，Creld2重组蛋白治疗组基因主要富集在内源性和外源性凋亡信号通路下调、MAPK级联反应下调、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性下调等，与上述表型结果一致，即Creld2降低辐照后调往损伤。相应地，KEGG分析显示Creld2参与调控内质网蛋白质加工进程(proteinprocessinginendoplasmicreticulum)。进一步免疫印迹验证实验显示，Creld2上调未折叠蛋白反应(UPR)中伴侣蛋白GRP78的表达，同时上调UPR下游通路中核心蛋白phosphoPERK和phosphoIRE1α的表达。此外，测序结果提示p38MAPK属于高频差异基因，实时荧光定量PCR检测证实，Creld2治疗显著下调了CHOP、p38MAPK和Caspase3mRNA的表达;同时，免疫印迹实验证实，Creld2治疗显著下调了phosphop38及CleavedCaspase3蛋白的表达，即Creld2重组蛋白治疗可抑制辐照后凋亡相关通路中核心蛋白的表达。<br>　　4、TCGA数据库数据分析显示，与正常肠道组织相比，Creld2在结肠癌组织中的表达显著下调，在直肠癌组织中的表达无显著差异，而Creld2的表达水平对结直肠癌患者的预后无显著影响。临床结直肠癌肿瘤样品检测显示，Creld2在结直肠癌组织和癌旁组织中无显著差异性表达。结肠癌细胞HCT116离体实验显示，敲减Creld2可显著降低HCT116细胞的增殖活力，而Creld2过表达对HCT116细胞的增殖活力、迁移和侵袭能力无显著影响。<br>　　结论<br>　　外源性给予人Creld2重组蛋白或内源性介导Creld2过表达均可有效保护以肠隐窝干细胞为主的人小肠类器官免受辐射损伤;在作用机制方面证明，Creld2可能以PERK依赖性方式抑制其介导的p38MAPK凋亡通路以及上调UPR自适应系统（包括PERK及与其串扰的IRE1α通路），减少细胞凋亡，纠正内质网应激，保护肠隐窝干细胞免受辐射损伤;通过引入人结直肠癌肿瘤样本、肠癌细胞等，初步证明Creld2在有效防治RIII的同时，对结直肠肿瘤疾病进程及预后无显著影响。本课题首次阐明Creld2作为临床RIII防治靶标的可行性与作用机制，有望为临床肠辐射损伤防治靶标及药物研发提供新的研究方向。