整合素α6调控软骨终板退变过程中基质代谢和血管生成的机制研究-论文-万方医学网

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整合素α6调控软骨终板退变过程中基质代谢和血管生成的机制研究

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摘要随着现代生活节奏的加快，腰痛问题日益突出，椎间盘退变（Intervertebral Disc Degeneration,IDD）是导致腰痛的罪魁祸首，影响将近全球80％的人口。为了更深入地理解这一问题并探索解决方案，本文将详细探讨椎间盘退变的成因、机制以及潜在的治疗方法。椎间盘由内层的髓核（Nucleus pulposus，NP）、外层纤维环（Annulus fibrosus,AF）以及贴近上下椎体表面的软骨终板（Cartilage endplates,CEP）构成。这些组成部分协同作用，共同确保脊柱的稳定性和灵活性得以保持。在椎间盘退变的过程中，多种因素相互作用，包括机械刺激和化学性因素。这些因素导致椎间盘的组织结构发生变化，从而引发下腰痛。同时，椎间盘也是人体内最大的无血管组织，其营养血供主要依靠渗透作用。 　　在众多影响椎间盘退变的因素中，软骨终板退变和破坏是IDD发病的重要因素，而其潜在退变机制是目前研究热点。软骨终板是连接椎体与髓核的“桥梁”，作为桥梁，软骨终板的两大主要功能为营养供应及平衡应力。软骨终板退变的主要过程包括软骨细胞的衰老凋亡、软骨细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）分解合成代谢失衡、软骨内微小钙化以及软骨终板内血管重塑等。细胞外基质代谢异常以及血管重塑在椎间盘退变中发挥着重要作用。这两大潜在机制一直是软骨终板退变研究中的热点。细胞外基质是维持软骨细胞稳态的重要组成部分，主要由胶原蛋白（I型、Ⅱ型胶原等）、蛋白多糖（Aggrecan）以及促进分解代谢的金属蛋白酶（Metalloprotease,MMPs,如MMP3、MMP13）等构成，它们共同维持着软骨细胞性，针对整合素的机制及药理学研究不断进展。整合素家外基质的稳态。当CEP发生退变时，细胞外基质代谢紊乱，Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成与降解平衡被破坏，加速椎间盘退变。血管重塑在CEP退变中也扮演着重要角色。正常成年人的椎间盘内部不存在血管，髓核的营养供应主要依赖于贴近于软骨终板椎体侧毛细血管网络的渗透作用。随着软骨终板衰老及退变，软骨终板出现局部“微钙化”，渗透作用逐渐减弱。然而，在CEP退变过程中，血管生成被激活，新生的血管侵入椎间盘内部，破坏其原有的无血管状态。这些新生血管为退变组织提供营养，还可能引发炎症反应和疼痛等症状，进一步加剧退变。 　　整合素是细胞膜表面主要的黏附跨膜受体，整合素作为ECM-细胞骨架连接桥梁、生化信号及机械信号传感器。整合素的功能主要是通过蛋白质-蛋白质相互作用、亚基构象变化来调节整合素活性，从而达到整个复合体处于失活与激活动态改变的微妙状态下。由于整合素存在于细胞表面以及其对细胞外界环境改变的敏感族在椎间盘退变中起到重要作用，在平衡负载、调节ECM代谢方面均起到重要作用。 　　在前期课题组整合素α6的相关研究中，也发现在髓核细胞中，低氧环境可以通过诱导整合素α6升高来抑制髓核细胞退变。目前研究中，尚不存在针对整合素家族在软骨终板退变中相关功能的研究。综上所述，结合整合素α6的功能特点以及软骨终板的生理病理特性，我们拟通过探究整合素α6在软骨终板退变中的调控作用，来揭示软骨终板退变过程中ECM代谢以及血管重塑等深层机制，了解软骨终板退变的始末，明确椎间盘退变的根源所在。 　　目的: 　　（一）整合素α6在软骨终板退变的相关性研究 　　（二）探究整合素α6在软骨终板细胞外基质代谢中的作用 　　（三）明确整合素α6通过PI3k/AKT通路调节细胞外基质代谢 　　（四）探究整合素α6在软骨终板血管重塑中的调控作用 　　方法: 　　（一）整合素α6与软骨终板退变的相关性研究 　　1.人软骨终板标本获取，影像学评估（Modic分型）、腰痛VAS评分、ODI评分的相关性分析。 　　2.通过免疫组化染色确定软骨终板退变过程中IL-1β起到重要作用。 　　3.通过PCR检测退变软骨终板中整合素家族的表达情况。 　　4.通过免疫组化、PCR、Western blot等检测人软骨终板中ITGα6的表达情况。 　　5.体外IL-1β诱导软骨终板退变，不同的IL-1β刺激时间、刺激浓度来检测软骨终板退变过程中MMP13、Co12、ITGα6的表达情况。 　　6.使用腰椎不稳模型作为软骨终板退变体内模型，通过Micro-CT、HE、SOFG染色判断模型构建是否成功，通过免疫荧光检测MMP13、Co12、ITGα6的表达。 　　（二）整合素α6调节软骨终板细胞外基质代谢 　　1.体外质粒过表达ITGα6,通过Western blot、免疫荧光等检测软骨终板细胞退变情况。 　　2.通过小干扰 RNA（small interfering RNA,siRNA）沉默 ITGα6，通过 Western blot、免疫荧光检测软骨终板细胞退变情况。 　　3.通过构建ITGα6软骨终板特异性敲除小鼠，通过Micro-CT、番红固绿染色判断软骨终板退变程度，通过免疫荧光检测MMP13、Co12、ITGα6的表达。进一步验证ITGα6在软骨终板退变中的调控作用。 　　4.通过高通量测序筛选出可能发生变化的信号通路，敲除ITGα6通过Western blot检测通路蛋白的表达情况。 　　（三）整合素α6调控软骨终板新生血管长入 　　1.免疫荧光检测LSI小鼠终板退变模型中血管标记物CD31的表达情况。 　　2.体外使用CCK8、划痕试验验证过表达软骨终板细胞ITGα6对人脐静脉血管内皮细胞的影响。 　　3.通过构建条件敲除小鼠进一步验证在ITGα6在软骨终板血管长入中的作用。 　　结果: 　　（一）整合素α6与在软骨终板退变的相关性研究 　　1.ModicI型改变与患者腰痛具有显著相关性。 　　2.IL-1β在人软骨终板退变标本中表达上升。 　　3.退变软骨终板检测整合素家族表达，ITGα6下降最明显。 　　4.Modic I型改变的人软骨终板中ITGα6表达下降。 　　5.随着IL-1β刺激时间以及刺激浓度的不断增加，MMP13表达逐渐上升、ITGα6和Co12表达逐渐下降。 　　6.腰椎不稳模型可以成功导致小鼠软骨终板退变，体内验证在小鼠软骨终板退变的过程中MMP13逐渐上升、ITGα6和Co12逐渐下降。 　　（二）整合素α6调节软骨终板细胞外基质代谢 　　1.炎症状态下过表达ITGα6可以抑制软骨终板细胞外基质代谢紊乱。 　　2.ITGα6在软骨终板细胞内的缺失会导致软骨终板退变加剧。 　　3.通过构建ITGα6软骨终板特异性敲除小鼠，发现缺乏ITGα6的小鼠软骨终板退变加速。 　　4.通过高通量测序筛选出PI3K/AKT通路在软骨终板退变过程中被抑制，敲除ITGα6通过Western blot检测通道蛋白AKT、p-AKT的表达情况，提示ITGα6可能通过PI3K/AKT通路调节细胞外基质代谢。 　　（三）整合素α6调控软骨终板血管长入 　　1、LSI小鼠终板退变模型中血管标志物CD31的表达上升。 　　2、过表达软骨终板ITGα6可促进入脐静脉血管内皮细胞增殖。 　　3、ITGα6条件敲除小鼠中发现软骨终板ITGα6缺失会促进软骨终板新生血管长入。 　　结论: 　　整合素α6在调控软骨终板基质代谢以及影响软骨终板血管重塑方面起到重要作用。高表达ITGα6可通过PI3K/AKT通路抑制软骨终板细胞外基质代谢紊乱，抑制新生血管异常长入。