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摘要背景:在全球范围内，原发性肝癌是常见的恶性肿瘤，是全球癌症患者死亡的第三大原因。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的肝癌类型，占原发性肝癌85％以上。由于肝癌细胞增殖迅速，起病隐匿，多数患者确诊时已处于中晚期，导致患者生存率较低，临床预后效果不佳。目前主要的治疗方法有手术切除、肝移植、放射性治疗、免疫结合靶向治疗等，由于大部分患者在肿瘤不可被切除的中晚期被诊断，故此时根治性疗法不再适用，免疫靶向结合放、化疗是较为常见的方案，随着化疗药物的剂量和给药时间增多，毒副作用加强，严重影响患者的生存质量，所以寻求毒副作用较小的抗肿瘤治疗方法十分重要。益生菌因为其抗炎、促进消化、调节菌群平衡等特性，展现出消化道疾病治疗的优势，近年来研究表明益生菌也表现出抗癌疗效，逐渐成为新型靶向药物的研究焦点。益生菌通过作用于肠道菌群稳态，在各种生理病理反应中发挥关键作用。凝结芽孢杆菌是一种稳定的益生菌，近年来它被广泛应用于医疗、科学研究等领域。<br>　　线粒体是生物体产生能量的重要细胞器，参与维持细胞正常的生理过程。当外界因素破坏线粒体稳态后，线粒体能量代谢异常，引发肿瘤细胞异常反应，导致细胞发生程序性死亡，线粒体凋亡与肿瘤的发生发展密切相关。经研究发现TGF-β1/Smads通路是细胞信号调控的重要通路，在肝癌不同生物学行为中高度活跃，激活后，调控凋亡相关基因的转录、翻译，进而调控肝癌细胞的生物学行为。<br>　　课题组前期研究发现，凝结芽孢杆菌MZY531可以抑制H22小鼠肝癌细胞的增殖，并抑制肝癌细胞侵袭转移，具有抗肝癌作用，但凝结芽孢杆菌MZY531对人肝癌细胞线粒体凋亡的作用机制尚不明确。本研究通过设计实验，进一步探究凝结芽孢杆菌MZY531的抗肝癌作用机制，为肝癌治疗提供新的思路和理论基础。<br>　　目的:本研究通过设计实验，探讨凝结芽孢杆菌MZY531通过TGF-β1/Smads信号通路诱导人肝癌细胞HepG2和Huh7线粒体凋亡的作用机制。<br>　　方法:采用CCK-8法检测凝结芽孢杆菌MZY531对人肝癌细胞HepG2和Huh7增殖的作用;利用碘化丙啶单染检测MZY531对HepG2和Huh7细胞周期的影响;Hoechst33342染色后在荧光显微镜下观察MZY531对人肝癌细胞凋亡的作用;AnnexinV/PI双染法检测MZY531作用后人肝癌细胞的凋亡率变化;利用荧光探针JC-1检测MZY531对人肝癌细胞线粒体膜电位的影响;Western blot法检测MZY531对人肝癌细胞中线粒体凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3、Cyt-c、Bcl-2和Bax的表达情况。为了检测MZY531对TGF-β1/Smads通路的作用，通过Western blot检测TGF-β1/Smads通路相关蛋白TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad4的表达，然后加入通路激活剂TGF-β1进一步探究 MZY531通过TGF-β1/Smads信号通路诱导肝癌细胞线粒体凋亡的作用机制。<br>　　结果:凝结芽孢杆菌MZY531抑制人肝癌细胞HepG2和Huh7增殖，并具有浓度-时间依赖性，碘化丙啶单染结果显示，MZY531作用后，人肝癌细胞被阻滞在GO/G1期，利用Hoechst33342染色后，在镜下观察发现，MZY531作用后，凋亡细胞增多，AnnexinV/PI双染法检测结果显示，随着MZY531作用浓度的升高，人肝癌细胞的凋亡率呈上升趋势，以上结果说明MZY531可以诱导人肝癌细胞凋亡，然后通过荧光探针法检测发现，MZY531作用后，人肝癌细胞中线粒体膜电位显著降低，线粒体凋亡关键蛋白Cleavedcaspase-3、Cyt-c表达水平上调，Bcl-2/Bax下降，提示MZY531诱导人肝癌细胞线粒体凋亡。通过检测TGF-β1/Smads 通路相关蛋白 TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad4 的表达发现，MZY531作用后，上述蛋白的表达量明显减少，说明MZY531抑制TGF-β1/Smads通路。为进一步验证MZY531通过TGF-β1/Smads通路诱导人肝癌细胞线粒体凋亡的作用机制，加入TGF-β1/Smads通路激活剂TGF-β1,实验结果显示，与空白对照组比较，激活剂TGF-β1组中，人肝癌细胞的凋亡率明显下降，线粒体膜电位升高。与激活剂TGF-β1组比较，MZY531+TGF-β1组中凋亡率显著增加，线粒体膜电位明显下降，TGF-β1/Smads通路相关蛋白p-Smad2、p-Smad3、Smad4的表达水平明显下调，Bcl-2/Bax下降。以上实验结果说明凝结芽孢杆菌MZY531通过TGF-β1/Smads通路诱导人肝癌细胞发生线粒体凋亡。<br>　　研究结论:<br>　　1.凝结芽孢杆菌MZY531可以抑制人肝癌细胞增殖，诱导人肝癌细胞线粒体凋亡;<br>　　2.凝结芽孢杆菌MZY531可能是通过TGF-β1/Smads通路诱导人肝癌细胞线粒体凋亡。