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摘要背景<br>　　NK/T细胞淋巴瘤(NK/T cell lymphoma,NKTCL)是我国较常见的一种高度侵袭性、预后较差的恶性肿瘤，主要起源于活化的NK细胞，少数则起源于细胞毒性T淋巴细胞，以血管浸润与破坏、显著坏死、高表达的细胞毒性表型以及EB病毒感染为主要特征。目前对NKTCL发病机制的研究取得了一定进展，但具体的发病机制尚未完全清楚，现有的治疗方法包括化疗、放疗及免疫治疗等，但总体生存期短，预后较差，尤其是晚期、进展期患者。因此，NKTCL亟需有效的治疗探索来提高治愈率、延长患者的生存期。酸性核磷蛋白32A(Acidic nuclear phosphoprotein 32 family member A,ANP32A)是ANP32 家族中的成员之一，也是蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A,PP2A)抑制剂，在细胞的多种生命过程，如增殖、信号转导、凋亡、转录调控等过程中发挥重要作用。有研究表明，ANP32A作为一种新的组蛋白调节剂，可能通过改变关键途径(包括脂质代谢)上组蛋白H3乙酰化来促进白血病的发生与发展。Polo样激酶1(Polo-like kinase 1,PLK1)是一类高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是Polo样激酶家族中的重要成员之一，PLK1通过磷酸化不同的特异性底物，在细胞周期进程和有丝分裂的多个阶段中发挥重要作用，是促进细胞增殖的关键蛋白。多项研究发现PLK1的异常激活在多种淋巴造血及免疫相关肿瘤的发生发展中起重要作用。综上推测ANP32A与PLK1的异常激活可能参与了NKTCL的进展，但二者在NKTCL中的表达情况、作用机制及临床意义尚不明确。鉴于此，本文将进行以下研究，为进一步探究NKTCL的发病机制、探索NKTCL治疗新途径提供理论基础。<br>　　目的<br>　　1.检测NKTCL中的PLK1蛋白及其活性磷酸化水平(p-PLK1)，并分析其表达与临床特征、病理学参数及预后之间的关系。<br>　　2.检测NKTCL中ANP32A的蛋白水平，并分析其表达与PLK1和p-PLK1的相关性及与临床特征、病理学参数及预后之间的关系。<br>　　3.分析过表达ANP32A对PLK1表达水平及p-PLK1修饰水平的影响。<br>　　方法<br>　　1.收集2019年1月至2021年10月郑州大学第一附属医院根据2017年版《WHO淋巴与造血组织肿瘤分类》确诊的NKTCL患者的石蜡组织标本40例作为实验组;另收集同期20例鼻咽部黏膜淋巴组织增生性病变组织标本作为对照。<br>　　2.收集上述病例的相关临床数据:年龄、性别、首发部位、临床分期(Ann Arbor分期)、PINK-E预后指数评分、有无B症状、血清乳酸脱氢酶(LDH)及P2微球蛋白(P2-MG)含量、血EBV-DNA水平、Ki-67增殖指数、有无骨髓侵犯及淋巴结转移、预后资料等。<br>　　3.在40例实验组及20例对照组中进行ANP32A、PLK1、p-PLK1的免疫组化检测，分析比较其表达差异，并分析ANP32A和PLK1及其活性磷酸化水平之间的相关性关系。<br>　　4.进行CCK8细胞增殖实验，加入PLK1抑制剂后观察NKTCL细胞系的增殖能力。<br>　　5.构建ANP32A过表达细胞系，通过Western blot分析过表达ANP32A对PLK1表达水平、p-PLK1修饰水平的影响。<br>　　6.探究上述3个指标(ANP32A、PLK1、p-PLK1)与搜集到的临床相关数据及预后之间的关系。<br>　　7.采用SPSS26.0及GraphPad Prism8.0软件进行统计分析及作图:计数资料的比较采用卡方检验或Fisher确切概率法;相关性分析采用Spearman秩等级相关法;生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线法;采用ROC曲线分析预后判断的诊断价值。双侧P值＜0.05为差异具有统计学意义。<br>　　结果<br>　　1.临床特征:随访时间截止到2023年2月15日，40例患者中，男27例,女13例，年龄范围12～80岁(中位年龄51岁)。随访时间0.5～48个月，中位随访时间为24个月。截至随访终点，11例患者死亡，2例患者失访，余27例患者存活至今。平均生存时间为36个月，3年生存率为70.9％。<br>　　2.PLK1在NKTCL组织中表达升高:PLK1阳性信号定位于细胞核，40例NKTCL患者肿瘤细胞呈阳性表达，高表达者占比为45％(18/40);与实验组阳性百分比及着色强度对比，其在对照组中不表达或呈弱表达。<br>　　3.PLK1磷酸化修饰水平在NKTCL组织中升高:p-PLK1阳性信号定位于细胞核，40例NKTCL患者肿瘤细胞呈阳性表达，高表达者占比为55％(22/40);与实验组阳性百分比及着色强度对比，其在对照组中不表达或呈弱表达。<br>　　4.PLK1蛋白及磷酸化修饰水平升高均提示NKTCL不良预后:采用Kaplan-Meier法对患者的PLK1及p-PLK1进行生存分析，结果显示，PLK1高表达组的OS显著低于低表达组(P=0.003)，高表达组与低表达组的3年OS率分别为47.1％、90.5％;p-PLK1高表达组的OS显著低于低表达组(P=0.005)，高表达组与低表达组的3年OS率分别为52.4％、94.1％。PLK1及p-PLK1对于NKTCL预后判断的ROC曲线分析结果显示，对于确诊1年及3年的患者来说，p-PLK1预测预后情况的AUC值分别为0.797及0.674,略高于PLK1的0.755及0.654;而对于确诊2年的患者来说，PLK1预测其预后情况的AUC值为0.843,高于p-PLK1 的 0.721。<br>　　5.PLK1、p-PLK1与Ki-67在NKTCL组织中存在正相关关系:Spearman相关性分析显示，PLK1及p-PLK1与Ki-67阳性率之间均存在正相关关系(r=0.613,P＜0.0001;r=0.714,P＜0.0001).<br>　　6.抑制PLK1可以抑制NKTCL细胞系增殖能力:CCK8细胞增殖实验结果显示，在加入PLK1抑制剂后，NKYS细胞增殖能力受到显著抑制。<br>　　7.ANP32A在NKTCL组织中高表达并可激活PLK1:ANP32A阳性信号定位于细胞核，40例NKTCL患者肿瘤细胞呈阳性表达，高表达者占比为40％(16/40);与实验组阳性百分比及着色强度对比，其在对照组中不表达或呈弱表达。Kaplan-Meier生存曲线图显示，ANP32A高表达组的OS显著低于低表达组(P＜0.001)，高表达组与低表达组的3年OS率分别为37.5％、95.0％。其对于NKTCL预后判断的ROC曲线分析结果显示，对于确诊NKTCL 1年至3年的患者来说，ANP32A预测NKTCL预后情况差别不大，AUC值分别为0.889、0.834及0.862。Spearman相关性分析显示，ANP32A与PLK1及p-PLK1在NKTCL组织中均存在正相关关系(r=0.492,P=0.001;r=0.533,P＜0.001)。进一步分析过表达ANP32A对PLK1蛋白表达水平及其磷酸化修饰水平的影响，Western blot结果显示，过表达ANP32A，PLK1磷酸化修饰水平升高，PLK1蛋白表达量无变化。<br>　　8.ANP32A、PLK1和p-PLK1表达与NKTCL患者临床特征的关系:卡方检验分析结果显示，NKTCL患者ANP32A的表达与性别、PINK-E评分以及淋巴结转移情况在组间分布差异有统计学意义(分别P=0.027、P=0.001及P=0.029);PLK1的表达与血EBV-DNA含量在组间分布差异有统计学意义(P=0.025);p-PLK1的修饰水平与发生部位在组间分布差异有统计学意义(P=0.024);其余各项临床指标在三种蛋白的高表达组与低表达组之间的分布均没有统计学差异(P＞0.05)。<br>　　9.临床病理学参数与NKTCL预后分析:采用Kapjlan-Meier法分析各项临床资料，结果显示，PINK-E预后评分中高危组、高LDH含量和高β2-MG含量组的患者具有更低的OS(P＜0.05)。性别、年龄、发生部位、AnnArbor分期、有无B症状、血EBV-DNA含量、骨髓侵犯、淋巴结转移情况以及Ki-67增殖指数对患者预后均无明显影响(P＞0.05),差异不具有统计学意义。<br>　　结论<br>　　1.ANP32A和PLK1蛋白表达水平及p-PLK1修饰水平在NKTCL组织中显著升高，并与患者不良预后相关，可能作为诊断和预后判断的潜在生物标志物。<br>　　2.ANP32A能够增强PLK1磷酸化修饰水平，但其在NKTCL中的作用机制仍需进一步研究，进而为开发针对NKTCL的新型治疗策略提供潜在的靶点。