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摘要目的<br>　　T-2毒素是单端孢霉烯族毒素中毒性最强的真菌毒素，可诱导骨与软骨发育障碍。然而，T-2毒素致关节软骨损伤的发病机制尚不完全清楚。硒代蛋氨酸(Selenomethionine,Se-Met)作为一种有机硒源，具有抗氧化应激作用，能够拮抗T-2毒素引起的肝损伤、肠道损伤和免疫毒性等;但Se-Met能否改善T-2诱导软骨细胞损伤仍需深入研究。因此，本研究采用体内和体外染毒模型相结合，揭示T-2毒素致软骨细胞铁死亡的分子机制，明确Se-Met对T-2毒素诱导软骨细胞损伤的保护作用。<br>　　方法<br>　　1.体外软骨细胞染毒模型构建及干预剂量筛选<br>　　采用SW1353细胞构建体外软骨细胞染毒模型，给予不同浓度T-2毒素(1、5、10、20、40、80、160、320ng/mL)、铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1,Fer-1;0.1、0.4、1、5、10μM)和Se-Met(0.1、0.5、1、2、4μM)分别干预软骨细胞24h，通过CCK-8试剂盒检测软骨细胞活力，筛选后续染毒实验干预剂量。<br>　　2.软骨细胞差异表达基因筛选<br>　　以10ng/mLT-2毒素干预软骨细胞24h后，提取软骨细胞总RNA,进行mRNA转录组测序，筛选染毒软骨细胞差异表达基因，其筛选标准为P＜0.01且|log2(foldchange)|＞2。将差异表达基因与铁死亡相关基因进行比对分析，重叠基因进行基因本体(Geneontology,GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes,KEGG)通路富集分析以及蛋白质互作网络(Protein-Proteininteractionnetwork,PPI)分析。P＜0.05被认为差异有统计学意义。<br>　　3.软骨细胞铁死亡相关因子检测<br>　　以5、10、20ng/mLT-2毒素染毒软骨细胞24h，采用DCFH-DA荧光探针和C11BODIPY探针分别检测软骨细胞内活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)、脂质活性氧(Lipidreactiveoxygenspecies,LipidROS)水平。比色法检测软骨细胞丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione，GSH)和Fe2+水平。用免疫荧光法检测软骨细胞谷胱甘肽过氧化酶4(GlutathionePeroxidase4,GPX4)表达水平。以5μMFer-1和1μMSe-Met预处理软骨细胞2h后，再以20ng/mLT-2毒素染毒24h。采用透射电镜观察Fer-1和Se-Met分别对染毒软骨细胞线粒体超微结构影响。检测Fer-1和Se-Met对软骨细胞内铁死亡相关因子(ROS、LipidROS、MDA、GSH、GPX4和Fe2+)水平的影响。<br>　　4.检测软骨细胞铁死亡通路相关基因和蛋白表达水平<br>　　实时定量聚合酶链式反应(Real-timequantativepolymerasechainreaction,RT-qPCR)检测软骨细胞铁死亡相关基因GPX4、SLC7A11和PTGS2mRNA表达水平。Westernblot检测软骨细胞铁死亡相关蛋白PTGS2、SLC7A11、GPX4和ACSL4表达水平。<br>　　5.构建SD大鼠T-2毒素染毒模型<br>　　从河南省动物实验中心购买48只4周龄SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠，随机分为对照组、T-2toxin组、Se-Met组、T-2toxin+Se-Met组，连续灌胃T-2毒素4周后，收集大鼠膝关节骨组织，HE染色观察关节软骨及骺板软骨形态学改变。<br>　　6.观察大鼠骨微细结构及局部定量分析<br>　　染毒结束后收集大鼠膝关节，用微计算机断层扫描技术(Microcomputedtomography,Micro-CT)扫描大鼠膝关节，并进行三维重建，以胫骨近端骨小梁作为感兴趣区域(Regionofinterest，ROI)进行定量分析以下参数:骨体积分数、骨表面密度、骨小梁分离度、骨小梁数量。<br>　　7.检测软骨组织铁死亡相关指标<br>　　比色法检测大鼠关节软骨组织MDA、GSH和总铁含量;免疫组织化学法检测大鼠关节软骨组织中铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11、PTGS2和4-HNE的阳性表达率。Westernblot检测大鼠关节软骨组织铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11、PTGS2和ACSL4表达水平。<br>　　8.统计学分析<br>　　使用SPSS26.0和GraphPadPrism8进行统计分析和统计绘图。实验数据采用均数±标准差(Mean±SD)描述，多组间比较采用单因素方差分析，两组间差异采用Least-SignificantDifference(LSD)检验进行分析。ImageJ软件量化蛋白条带灰度值。P＜0.05被认为差异具有统计学意义。<br>　　结果<br>　　1.T-2毒素诱导软骨细胞活力下降<br>　　随着T-2毒素浓度升高，软骨细胞存活率逐渐下降。T-2毒素致软骨细胞半抑制率IC50（95％CI:23.69,46.73ng/mL）=33ng/mL,因此本研究后续T-2毒素染毒剂量分别为5、10和20ng/mL。<br>　　2.T-2毒素诱导软骨细胞铁死亡通路显著表达<br>　　转录组测序共筛选出1422个差异表达基因（1034个上调和388个下调基因），与FerrDbdatabase中提取的铁死亡相关基因进行比对分析，共得到42个重叠基因。GO和KEGG通路富集分析发现T-2毒素诱导软骨细胞铁死亡通路显著表达。对42个重叠基因进行PPI分析，并识别出6个Hub基因（PTGS2、IL6、PARP1、GLS2、ADIPOQ和ALOX5）。<br>　　3.T-2毒素抑制SystemXc-/GSH/GPX4轴诱导软骨细胞铁死亡<br>　　随着T-2毒素浓度增加，软骨细胞ROS、LipidROS、MDA和Fe2+水平逐渐升高，GSH和GPX4水平逐渐降低（P＜0.05）。与T-2toxin组相比，T-2toxin+Fer-1组软骨细胞ROS、LipidROS、MDA和Fe2+水平下降（P＜0.05）,GSH和GPX4水平升高。透射电镜观察染毒软骨细胞线粒体超微结构，发现线粒体膜破裂、嵴减少、线粒体皱缩，而Fer-1显著改善T-2毒素诱导的软骨细胞线粒体结构损伤。T-2toxin组软骨细胞GPX4和SLC7A11基因和蛋白表达水平降低（P＜0.05）,PTGS2和ACSL4基因和蛋白表达水平升高（P＜0.05）。而T-2toxin与Fer-1联合处理能显著升高GPX4和SLC7A11基因和蛋白表达水平，降低PTGS2和ACSL4基因和蛋白表达水平。<br>　　4.Se-Met改善T-2毒素诱导的软骨细胞铁死亡<br>　　透射电镜可见Se-Met能够减轻T-2毒素导致的线粒体皱缩，膜破裂，嵴减少或消失等损伤。且Se-Met显著降低染毒软骨细胞ROS、LipidROS、MDA、Fe2+水平，升高GSH和GPX4表达水平。RT-qPCR结果显示，Se-Met逆转T-2毒素所致PTGS2和ACSL4mRNA表达上调和SLC7A11和GPX4mRNA表达水平下调。此外，Westernblot结果显示，Se-Met可显著降低染毒软骨细胞PTGS2和ACSL4蛋白表达水平，并升高染毒软骨细胞SLC7A11和GPX4蛋白表达水平（所有P＜0.05）。<br>　　5.Se-Met改善T-2毒素致大鼠关节软骨组织损伤<br>　　HE染色显示，T-2toxin组大鼠关节软骨细胞形态紊乱，细胞数量减少，可见“红色鬼影”细胞。大鼠骺板软骨细胞排列紊乱，部分细胞消失成为无结构区域，而Se-Met可改善T-2毒素所致关节软骨和骺板软骨细胞损伤。Micro-CT扫描膝关节，并对胫骨近端ROI区域定量分析显示，T-2toxin组大鼠BV/TV和Tb.N降低，Tb.Sp和BS/TV升高，而T-2toxin+Se-Met组大鼠骨小梁形成率高于T-2toxin组，差异无统计学意义。<br>　　6.Se-Met改善T-2毒素诱导软骨细胞铁死亡<br>　　Se-Met显著改善T-2毒素诱导的关节软骨组织GSH含量下降、MDA和组织铁含量升高（所有P＜0.05）。免疫组化和Westernblot结果均显示，与T-2toxin组相比，T-2toxin+Se-Met组GPX4和SLC7A11蛋白表达升高，PTGS2和4-HNE和ACSL4蛋白表达降低（P＜0.05）。<br>　　结论<br>　　T-2毒素抑制SystemXc-/GSH/GPX4轴诱导软骨细胞铁死亡，而Se-Met通过上调SLC7A11和GPX4表达，抑制T-2毒素诱导的软骨细胞铁死亡，从而改善T-2毒素致关节软骨损伤。