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摘要目的<br>　　肿瘤驻留的胞内细菌作为不可忽视的肿瘤组成成分，对癌症风险、病理类型、癌症预后和治疗反应等有着深远影响，其中乳腺癌中肿瘤驻留的胞内菌(如金黄色葡萄球菌，简称为金葡菌)在乳腺癌转移过程中发挥着重要作用。同时肿瘤驻留胞内菌具备低生物量的特性。鉴于此，以金葡菌为模型细菌，其所含的16S核糖体RNA(16SrRNA)为研究对象，联合运用分子信标的荧光“激活”性能和环糊精的荧光增敏，构建激活式超分子荧光纳米探针用于肿瘤驻留胞内细菌的共定位成像检测。在溶液中金葡菌检测的基础上，进一步通过构建MCF-7细胞内金葡菌模型、驻留有胞内金葡菌的MCF-7乳腺癌小鼠移植瘤模型，从细胞和组织层面验证了所构建的探针对肿瘤驻留胞内细菌共定位成像检测的应用。为乳腺癌转移早期预警提供了一种特异性强、灵敏度高、不易受组织微环境干扰的共定位成像检测新方法。<br>　　方法<br>　　1.激活式超分子荧光纳米探针构建与表征<br>　　激活式超分子荧光纳米探针由通用型激活式超分子荧光纳米探针(CMB-PEG-β-CD)和特异型激活式超分子荧光纳米探针(SMB-PEG-β-CD)组成。利用通用分子信标(CMB)或特异分子信标(SMB)茎部修饰的氨基，与线性聚乙二醇连接臂(DBCO-PEG-NHSester)进行酰胺反应后，继续与叠氮修饰的β-环糊精(N3-β-CD)进行点击化学反应，即可分别制备CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD。CMB-PEG-β-CD的核酸序列是根据大多数细菌中16SrRNA的非特异性序列设计，便于其识别大多数细菌;SMB-PEG-β-CD的核酸序列是根据金葡菌中16SrRNA的特异性序列设计，可靶向识别金葡菌。利用基质辅助激光解离飞行时间质谱和聚丙烯凝胶电泳对其进行表征。<br>　　2.CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD的相关性能研究<br>　　分别对CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD探针进行体外光谱性质、光稳定性、抗酶切性能和细胞活力检测的研究。采用荧光光谱仪对探针的目标物响应性能及荧光增敏性能进行研究;利用多功能读板机测量探针与目标物结合后，在不同溶液体系中经紫外灯辐射不同时间后的荧光强度变化，验证其光稳定性;采用聚丙烯凝胶电泳实验考察探针与核酸外切酶Ⅰ(ExoⅠ)孵育后的核酸序列完整性，验证其抗酶切性能;最后，为进一步在细胞及组织层面进行相关应用，利用MTT实验评估探针对细胞活力的影响。<br>　　3.CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD用于不同细菌的区分效果研究<br>　　以金葡菌为目标细菌、铜绿假单胞杆菌为对照细菌，观察目标细菌的菌落形态;利用传统表型鉴定方法如哥伦比亚血琼脂平板、革兰氏染色镜检确定所培养的细菌为目标细菌;进一步用CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD混合探针体系分别与细胞壁透化处理后的金葡菌和铜绿假单胞杆菌孵育，通过激光共聚焦显微镜成像考察CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD对两种细菌的区分效果。<br>　　4.CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD用于肿瘤驻留胞内菌检测的研究<br>　　CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD用于MCF-7细胞内金葡菌检测:首先，以人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)作为目标细胞，金葡菌作为目标细菌，利用金葡菌侵袭MCF-7细胞构建胞内菌模型。之后，利用CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD的混合探针体系与细胞壁透化处理后的胞内菌模型进行孵育，通过激光共聚焦显微镜成像考察该探针体系对MCF-7细胞内金葡菌的检测效果。<br>　　CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD用于MCF-7乳腺癌小鼠移植瘤模型来源的组织切片中胞内金葡菌检测:建立驻留有胞内金葡菌的MCF-7乳腺癌小鼠移植瘤模型，获取其组织切片。之后，联合运用构建的CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD与组织切片进行孵育，考察其对MCF-7乳腺癌小鼠肿瘤组织中胞内细菌的检测效果。验证其在肿瘤组织驻留胞内菌检测中的应用。<br>　　结果<br>　　1.CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD表征<br>　　CMB-PEG-β-CD质谱结果显示检测分子量为11418.0Da,理论分子量是11413.6Da;SMB-PEG-β-CD质谱结果显示检测分子量为11480.0Da,理论分子量是11474.7Da;上述结果表明两种探针已成功制备。聚丙烯凝胶电泳结果显示，相比于CMB和SMB,CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD对应的条带明显上移，且二者均可与对应互补链杂交。质谱和电泳结果表明CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD探针已成功制备，且可特异性识别对应目标序列。<br>　　2.CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD的相关性能<br>　　相比于CMB,目标物存在时CMB-PEG-β-CD荧光增强约1.32倍;相比于SMB,目标物存在时SMB-PEG-β-CD荧光增强约1.71倍，表明探针中环糊精的存在可有效增敏荧光。在不同溶液体系（PBS和10％FBS培养基）中探针与目标物结合后，监测紫外灯辐射不同时间后的荧光强度变化，结果显示辐射10h后，其荧光强度保持在初始荧光强度的80％以上，表明其具备较高的光稳定性。聚丙烯凝胶电泳结果显示CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD分别与0.25U/μLExoⅠ孵育10h后，二者均能保证核酸序列的完整性，表明探针具备好的抗酶切性能。MTT实验结果显示细胞存活率达85％以上，表明探针对细胞活力影响小，有利于后续应用到细胞和组织中胞内菌的荧光成像。<br>　　3.CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD用于不同细菌的区分<br>　　CMB-PEG-β-CD（伪色设为绿色）和SMB-PEG-β-CD（伪色设为红色）探针体系分别与金葡菌、铜绿假单胞杆菌孵育，共聚焦成像结果显示，相比于铜绿假单胞杆菌（仅呈现明亮的绿色），金葡菌呈现明亮的黄色荧光（绿色和红色的叠加色），且两种细菌的荧光均与菌体DAPI染色后的蓝色荧光重叠。以上结果表明CMB-PEG-β-CD作为通用型探针可识别金葡菌和铜绿假单胞杆菌，而SMB-PEG-β-CD作为金葡菌特异型探针仅识别金葡菌，证明所构建的探针体系可成功用于不同细菌的有效区分。<br>　　4.CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD用于肿瘤驻留胞内菌检测<br>　　金葡菌侵袭MCF-7细胞构建的胞内菌模型中，激光共聚焦成像结果显示CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD混合探针体系，能够有效识别胞内菌，MCF-7细胞内的金葡菌呈现明亮的黄色荧光（绿色和红色的叠加色），表明所构建的探针体系可成功用于MCF-7细胞内金葡菌的共定位成像检测。<br>　　驻留有胞内金葡菌的MCF-7乳腺癌小鼠移植瘤模型来源的组织切片中，激光共聚焦成像结果显示CMB-PEG-β-CD和SMB-PEG-β-CD混合探针体系，能够有效识别组织中的胞内菌，呈现出明亮的黄色荧光（绿色和红色的叠加色）;且代表金葡菌的共定位黄色荧光点与菌体DAPI染色后的蓝色荧光重叠，部分存在于细胞轮廓内、紧靠细胞核。表明所构建的探针体系可成功用于肿瘤组织中驻留胞内菌的共定位成像检测。<br>　　结论<br>　　本研究以金葡菌为模型细菌，其所含的16SrRNA为研究对象，联合运用分子信标的荧光“激活”性能和环糊精的荧光增敏，构建了激活式超分子荧光纳米探针，其具备特异性强、灵敏度高、不易受组织微环境干扰等优点;通过构建MCF-7细胞内金葡菌模型、驻留有胞内金葡菌的MCF-7乳腺癌小鼠移植瘤模型，从细胞和组织层面验证了所构建的探针可有效用于肿瘤驻留胞内细菌的共定位成像检测。