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摘要背景和目的<br>　　食管癌（Esophaguscancer，EC）是全球癌症相关死亡最主要的病因之一，主要有两种病理类型，为食管鳞癌（Esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC）与食管腺癌（Esophagealadenocacinoma，EAC）。在中国，食管鳞癌患者占食管癌患者的80％以上。近年来，食管癌的临床治疗方法取得了一些进展，但临床上食管癌患者五年生存率并未得到明显改善。因此，研究食管鳞癌的发病机制，寻找食管鳞癌新的治疗靶点对食管癌的临床治疗有着重要意义。<br>　　组蛋白翻译后修饰的紊乱，可促进肿瘤的发生和发展，如H3K27ac可激活肺癌相关成纤维细胞促进骨肉瘤的肺转移，H3K36me3高表达可促进三阴性乳腺癌转移相关基因上调。含溴域蛋白质9（Bromodomain-containingprotein9,BRD9）,是乙酰化读取蛋白家族中的一个重要成员，能够识别并结合组蛋白乙酰化的赖氨酸残基，在调节染色质结构和基因转录中扮演着重要的角色。但目前对于BRD9的研究多聚焦于BRD9在复合体中的作用，BRD9本身的识别位点与相应功能并没有明确的报道。同时，BRD9的表达或功能异常已被发现与肿瘤的发生和发展相关，如BRD9可通过影响雄激素受体信号、PIK3CA信号等通路调节癌症发生发展。然而，BRD9在食管鳞癌中的具体功能仍不明确。<br>　　Polo样激酶1（Polo-likekinase1，PLK1）在细胞有丝分裂过程中起着重要作用，参与调控细胞周期的进程，特别是在有丝分裂的各个阶段中发挥关键作用，如有丝分裂前期、纺锤体形成、染色体对齐和分裂等。PLK1的异常表达会导致食管鳞癌细胞的增殖、侵袭和转移能力增强，以及对化疗药物的耐药性增加。因此，PLK1是食管鳞癌的潜在治疗靶点之一，但目前已有的PLK1抑制剂临床治疗效果不佳，寻找新的PLK1调控方式对食管鳞癌的治疗有着重要意义。<br>　　本课题首次研究了BRD9在食管鳞癌中的表达水平与临床预后的相关性以及BRD9对食管鳞癌增殖的作用，并寻找其调控靶基因，阐述了其具体的分子机制，为BRD9作为食管癌治疗的新靶点提供了新的理论基础和研究依据。<br>　　方法<br>　　1.BRD9表达与食管鳞癌临床病理特征相关性分析:利用食管鳞癌组织微阵列免疫组化染色，分析患者组织中BRD9表达水平与患者临床病理特征之间的相关性。利用癌症基因组图谱（TheCancerGenomeAtlas,TCGA）数据库分析食管癌患者中BRD9的mRNA表达水平变化。利用临床患者组织样本通过Westernblot分析食管鳞癌中BRD9的蛋白表达水平。<br>　　2.BRD9促进食管鳞癌细胞增殖的研究:通过慢病毒介导的CRISPR/Cas9系统在食管鳞癌细胞系KYSE150和KYSE450中敲除BRD9。细胞增殖实验、平板克隆形成实验评估BRD9的敲除对食管鳞癌细胞增殖的影响。在KYSE510细胞系中过表达BRD9,通过细胞增殖实验和平板克隆形成实验评估BRD9过表达对食道鳞状上皮癌细胞增殖的影响。BRD9敲除的细胞系中恢复BRD9的表达，通过细胞增殖实验评估敲除细胞系中恢复BRD9后的细胞增殖能力。<br>　　3.BRD9激活PLK1转录，促进细胞有丝分裂的研究:使用RNA测序（RNAsequencing,RNA-seq）评价食管鳞癌细胞系中BRD9过表达后mRNA水平的变化。差异编码基因的基因本体论（GeneOntology,GO）富集分析被用来评价BRD9在基因转录中的作用。为了评价BRD9在基因转录中的直接作用，我们使用同批次细胞进行靶标裂解和标记测序（Cleavageundertargets&tagmentationsequencing,CUT&Tagseq）评价食管鳞癌细胞中BRD9结合的基因区域。对测序结果进行基因注释，对BRD9直接调控的基因进行基因富集分析。对RNA-seq富集的差异编码基因与CUT&Tag鉴定的TSS±2kb的基因进行韦恩分析，对共有基因进行GO富集分析，筛选BRD9直接调控的关键基因。通过qPCR实验和Westernblot实验验证筛选结果。通过固有有丝分裂实验（Intrinsicmitoticchromosomestructureassay,IMCS）检测BRD9对有丝分裂的影响。<br>　　4.BRD9与MSH6结合的研究:通过蛋白分子下拉实验联合质谱分析（Pull-down&Massspectrometry,Pulldown-MS），筛选BRD9的互作蛋白，通过细胞免疫荧光实验、内源性与外源性免疫共沉淀实验评价BRD9与MSH6的结合。<br>　　5.BRD9识别H2BK5ac、MSH6识别H3K36me3协同调控PLK1转录的研究:通过蛋白质分子下拉实验联合质谱分析筛选BRD9识别的组蛋白乙酰化位点。通过内源性免疫共沉淀实验对BRD9与H2BK5ac、MSH6与H3K36me3的结合进行验证。通过Westernblot、qPCR和双荧光报告基因实验确定BRD9与MSH6在PLK1转录上的协同作用。通过染色质免疫共沉淀（Chromatinimmunoprecipitation,ChIP）确定H2BK5ac与H3K36me3占据PLK1启动子区域的位置，进一步确定BRD9与MSH6对PLK1转录的调控作用。<br>　　6.BRD9与MSH6结合招募MTA2激活PLK1转录的研究:通过蛋白质分子下拉实验联合质谱分析筛选由BRD9招募的转录因子，通过内源性免疫共沉淀验证BRD9与MTA2的互作，通过外源性多重免疫共沉淀验证BRD9,MSH6,MTA2之间的相互关系。通过Westernblot、qPCR检测敲低MTA2后PLK1的表达。通过双荧光报告基因实验检测BRD9调控PLK1启动子区域。通过ChIP检测BRD9在PLK1启动子的占据。<br>　　结果<br>　　1.BRD9高表达与食管鳞癌预后呈负相关:食管鳞癌组织芯片的免疫组织化学分析表明，BRD9蛋白在食管鳞癌组织中的水平高于癌旁组织。BRD9与食管鳞癌患者临床特征相关性分析发现BRD9的高表达与患者的预后呈负相关。根据癌症基因组图谱数据分析，食管鳞癌中BRD9的mRNA水平升高。Westernblot证实，与癌旁组织和正常食管上皮组织相比，食管鳞癌组织样本中BRD9蛋白水平明显升高。<br>　　2.BRD9促进食管鳞癌细胞的增殖:细胞增殖实验与平板克隆形成实验显示发现BRD9敲除抑制食管鳞癌细胞增殖;BRD9过表达后细胞增殖实验与平板克隆形成实验结果发现BRD9过表达后促进食管鳞癌细胞增殖;在BRD9敲除的细胞系中恢复BRD9的表达，细胞增殖实验结果表明BRD9恢复后BRD9对试管鳞癌细胞克隆形成能力的抑制减弱。<br>　　3.BRD9激活PLK1转录，促进细胞有丝分裂:RNA-seq结果显示BRD9过表达后4765个编码基因上调，涉及细胞周期、代谢、DNA损伤修复等通路;5090个编码基因下调，主要影响氮化合物运输，组织生长，细胞压力应答等生物学过程。CUT&Tag测序结果显示BRD9主要占据基因启动子区域，主要影响细胞代谢过程，参与代谢通路，癌症通路等信号通路。BRD9占据的编码基因联合BRD9过表达后差异编码基因进行韦恩分析，结果发现BRD9调控PLK1转录。qPCR与Westernblot结果证明敲低BRD9后PLK1mRNA与蛋白质水平下调，过表达BRD9后PLK1mRNA与蛋白质水平上调。双荧光报告基因实验证明BRD9调控PLK1启动子区域转录，染色质免疫共沉淀实验证明BRD9在PLK1启动子区域占据。固有有丝分裂实验证明BRD9敲除后细胞有丝分裂受到抑制。<br>　　4.BRD9与MSH6相互结合:蛋白质分子下拉实验联合质谱分析筛选出BRD9互作蛋白MSH6,内外源性免疫共沉淀实验证明BRD9与MSH6在食管鳞癌细胞中互作。BRD9敲除及过表达细胞的免疫共沉淀实验进一步证明BRD9与MSH6在食管鳞癌细胞中存在相互结合。<br>　　5.BRD9识别H2BK5ac、MSH6识别H3K36me3调控PLK1转录:qPCR结果发现BRD9敲除与MSH6敲低可以协同下调PLK1mRNA水平表达，Westernblot结果表明BRD9的敲除与MSH6敲低可以共同下调PLK1蛋白水平表达。荧光报告基因实验确定BRD9与MSH6协同激活PLK1的转录。内源性免疫共沉淀证明食管鳞癌中BRD9与H2BK5ac，MSH6与H3K36me3的相互结合。CHIP实验证明H2BK5ac,H3K36me3结合在PLK1的启动子区域。<br>　　6.BRD9与MSH6结合后招募MTA2激活PLK1转录:蛋白质分子下拉实验联合质谱分析结果与人类转录因子数据库的韦恩分析筛选出BRD9互作转录因子转移相关蛋白2（Metastasis-associatedproteinMTA2,MTA2）。敲除MTA2后PLK1mRNA水平与蛋白水平表达下调。内源性免疫沉淀结果显示BRD9与MTA2相互结合，多重免疫沉淀实验证明BRD9结合MSH6与MTA2,双荧光报告基因与CHIP实验证明了MTA2对PLK1的调控作用。<br>　　结论<br>　　1.食管鳞癌中，BRD9高表达并与患者不良预后呈正相关。<br>　　2.食管鳞癌细胞中，BRD9与MSH6结合，分别识别H2BK5ac与H3K36me3,进而暴露PLK1启动子区域，招募转录因子MTA2,激活PLK1转录，导致PLK1高表达，促进细胞分裂。<br>　　3.食管鳞癌细胞中,BRD9通过MSH6/MTA2/PLK1轴促进食管鳞癌细胞增殖。