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摘要不孕不育是在全球范围内对育龄期夫妇造成巨大困扰的严重健康问题，在全球育龄期夫妇中的患病率约为8-12％,其中，由男性因素引起的不育约占所有病例的50％。深入探索男性不育的发病原因，研究其发病机制，改进临床诊疗方案，是全社会亟待解决的问题。<br>　　弱精子症是常见的男性不育类型，主要表现为精子运动能力严重减弱。弱精子症的致病原因主要可分为精子鞭毛超微结构异常和细胞功能性损伤两类，后者又与内分泌缺陷、生殖道感染、代谢异常、氧化应激损伤及环境污染等因素相关。<br>　　线粒体鞘是鞭毛中段紧密包绕在轴丝周围的鞘状结构。线粒体鞘的存在不仅使紧密排列的线粒体保持了较高的代谢效率，也在精子运动能力的调节中发挥着重要作用。线粒体通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷，为精子分化和活动提供能量支持。Ca2+稳态对于线粒体正常功能的维持是必须的，内质网作为细胞中的钙库，在Ca2+的储存和稳态调节中都发挥着重要作用。内质网还可以释放Ca2+，通过线粒体关联内质网膜(mitochondria-associated ER membranes,MAMs)进入线粒体内，从而影响线粒体的代谢。<br>　　膜占据和识别结合蛋白 2 ( membrane occupation and recognition nexus-motif protein 2,Morn2)是一个进化上保守并在睾丸中显著富集表达的基因。此前有研究称，MORN2特异性表达于生殖细胞，且表达起始时间与第一波精子发生大致同步，并猜测Morn2可能参与精子发生后期的顶体形成过程。其他研究发现，在涡虫内Morn2可在LC3相关吞噬作用和细菌感染耐受的建立中发挥一定功能。也有报道指出，MORN结构域在心肌细胞的生物电信号稳态维持中起到调节作用。然而，Morn2在精子发生及雄性生殖功能调控中的具体作用及机制仍属未知。<br>　　目的：<br>　　明确Morn2在精子发生及雄性生殖功能调控中的作用及其机制。<br>　　方法：<br>　　我们通过CRISPR/Cas9技术构建了 Morn2基因敲除（Morn2-/-）小鼠，通过生育力测试分析Morn2的缺失对小鼠生殖功能的影响，通过组织切片和HE染色分析Morn2-/-小鼠睾丸、附睾、精子和卵巢的形态变化，通过PAS染色和免疫荧光染色分析Morn2的缺失对睾丸和精子发育分期的影响，通过IVF实验分析Morn2-/-小鼠精子体外受精的变化。接下来，进一步通过免疫荧光染色分析了Morn2-/-小鼠精子组蛋白替换的进展和高尔基体、顶体及鞭毛相关结构的形态变化，借助透射电镜和扫描电镜解析Morn2基因敲除对精子鞭毛超微结构的影响。最后，通过一系列功能学实验分析了Morn2基因敲除对线粒体代谢水平和细胞内钙离子稳态的影响，借助体外细胞系过表达Morn2观察其亚细胞定位，通过蛋白质印迹实验检测了内质网应激相关蛋白的表达变化。<br>　　结果：<br>　　1. Morn2对于雄性生殖是必需的。<br>　　Morn2基因敲除雄鼠不育，其精子表现出以头部向鞭毛弯折为主的形态异常。<br>　　Morn2-/-小鼠精子运动能力显著下降，无法完成体内受精，且在体外受精时受精率和囊胚发育率也出现了明显下降，这些结果提示Morn2对于雄性生殖是必需的。<br>　　2. Morn2基因敲除引起精子线粒体鞘形成异常和线粒体代谢功能损伤。<br>　　Morn2-/-小鼠精子的线粒体肿胀肥大且形态异常，这些线粒体排列散乱，无法在鞭毛中段形成紧密的鞘状结构，提示Morn2的缺失会影响线粒体鞘的形成。此外,Morn2-/-小鼠精子中ROS水平升高，睾丸中凋亡信号增加且集中于延长型精子，提示Morn2的缺失诱发了氧化应激。Morn2-/-小鼠精子还表现出线粒体膜电位下降和ATP水平降低，提示Morn2基因敲除导致精子线粒体的代谢功能损伤。<br>　　3. Morn2基因敲除诱发内质网应激和钙离子稳态破坏。<br>　　通过体外细胞系过表达Morn2，我们发现MORN2蛋白在细胞中主要定位于内质网。<br>　　Morn2-/-小鼠睾丸中，内质网应激相关分子（ATF6、CRT、GRP94）表达异常，提示其内质网功能受损。此外，Morn2-/-小鼠精子中Ca2+水平升高，提示其精子细胞内钙离子稳态被破坏。转录组测序结果显示，Morn2-/-小鼠中上调的差异表达基因主要与离子通道的活性调节和阳离子（尤其是钙离子）的跨膜运输相关，这与其精子中升高的Ca2+水平相印证，共同说明Morn2的缺失会引起钙离子稳态失衡。<br>　　结论：<br>　　Morn2-/-小鼠表现为精子形态异常，运动能力显著下降和体外受精率降低，最终引起雄性不育，这些结果提示Morn2对于雄性生殖是必需的。此外，Morn2基因敲除还可以诱发内质网应激和钙离子稳态失衡，这种改变会损害线粒体功能，造成能量代谢受损和氧化应激的增加，同时还会引起线粒体鞘形成异常，以上结果说明Morn2不仅影响线粒体鞘形成，还在内质网和线粒体的功能调节中发挥重要作用。