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摘要研究背景:<br>　　椎间盘(Intervertebraldisc,IVD)是一种生理性承压器官，除了维持人体髓核组织的生理功能外，适当的机械应力在内部微环境中也起着重要作用。频繁的弯曲、扭曲、疲劳负荷和剧烈的体力活动与身体姿势和负重有关，可以显著改变髓核组织的应力。这些变化也会导致基质代谢紊乱，并加速椎间盘退变(Intervertebraldiscdegeneration,IVDD)的过程，这是一种与腰痛发展相关的复杂病理状况。机械性能的变化与椎间盘结构和成分的异常变化之间呈现正相关。<br>　　铁是人类必需的元素，生理浓度的铁在基本生命活动中发挥多种作用。铁代谢由几种蛋白质调节，包括用于铁运输和摄取的转铁蛋白受体(Transferrinreceptorprotein，TFRC)和二价金属转运蛋白1(Divalentmetaltransporter1，DMT1)、用于细胞内铁输出的铁蛋白(Ferroportin，FPN)和用于铁储存的铁蛋白(Ferritinheavychain1，FTH1)。然而，病理性铁积累可导致细胞发生氧化损伤和铁死亡。谷胱甘肽过氧化物酶4(GlutathionePeroxidase4,GPX4)可以作为判断细胞铁死亡的指标之一。当前，作为铁死亡核心调控因子，已被认为是细胞铁死亡研究的“明星分子”。<br>　　多细胞生物中的细胞永久暴露于机械应力下，产生和响应机械应力的能力对细胞行为和生命活动至关重要。机械应力可以有效地调节细胞活动，包括细胞增殖、凋亡、分化和自噬等。据报道，钙离子(Ca2+)可以通过机械敏感的压电1(Piezo-typemechanosensitiveionchannelcomponent1,Piezo1)通道对机械刺激做出反应。Piezo1在人体许多细胞表达并可以检测静压、剪切应力和膜拉伸等机械应力的刺激。除此之外，Piezo1是Ca2+介导的刚性细胞外基质(Extracellularmatrix，ECM)活化的机械转导介质。然而，机械转导的详细机制仍不完全清楚。<br>　　基于髓核细胞在椎间盘退变中的重要地位，以及机械压力、Piezo1离子通道、细胞铁代谢与铁死亡的潜在联系，本研究主要想探讨以下几点问题:(1)过度机械应力诱发的椎间盘退变中，Piezo1通道、铁死亡是否参与其中。(2)髓核细胞铁死亡在椎间盘退变的进展中扮演了何种角色，调控髓核细胞铁代谢会对椎间盘退变产生何种影响。(3)Piezo1、GPX4和铁之间是否存在联系，以及这种联系在髓核组织中是如何实现的。<br>　　研究方法:<br>　　(1)收集患者不同Pfirrmann分级的椎间盘髓核组织，进行普鲁士蓝染色和免疫组化分析，以探索椎间盘退变程度与铁积聚和铁死亡的关系。通过体外机械加压装置，对大鼠原代髓核细胞施加高强度机械压力刺激，进行mRNA转录组测序，以探所过度机械压力所引起的相关基因的异常表达及通路的改变。为阐明Piezo1与机械压力及铁死亡的联系，应用Piezo1抑制剂GsMTx4及铁死亡抑制剂Ferrostatin-1进行干预，同时通过透射电镜观察细胞加压后的线粒体形态及功能变化。此外，通过对细胞内铁含量的检测，以明确过度机械压力是否参与了细胞内铁的代谢。<br>　　(2)通过柠檬酸铁铵(Fmmoniumferriccitrate，FAC)制造细胞外高铁离子环境，在此基础上应用Piezo1的激动剂Yoda1和抑制剂GsMTx4进行药理学干预，为排除钙离子对细胞铁死亡的影响，使用无钙培养基作为对照。检测细胞内铁离子含量变化、细胞活性及细胞内丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平，通过透射电镜和膜电位检测观察线粒体形态及活性，同时检测铁代谢、铁死亡相关指标在基因和蛋白水平的表达情况，明确Piezo1分子蛋白是否响应机械压力刺激并参与其诱发的髓核细胞铁代谢紊乱。最后，为排除经典铁转运通道的影响，我们用小干扰RNA敲除了大鼠髓核细胞的转铁蛋白受体基因，继续进行机械及药物的刺激，并检测细胞内铁含量、活性氧及脂质过氧化的变化情况，以探讨Piezo1是否直接介导铁离子内流而与经典转铁蛋白受体途径无关，从而明确Piezo1调控铁代谢及铁死亡的深层机制。<br>　　(3)构建铁死亡调控基因Gpx4髓核细胞特异性条件敲除小鼠(Col2a1-CreERTGpx4flox/flox)、Piezo1条件性敲除小鼠(Col2a1-CreERTPiezo1flox/flox)和Piezo1/Gpx4条件性双敲除小鼠(Col2a1-CreERTPiezo1flox/flox/Gpx4flox/flox)。收集不同基因型小鼠的髓核组织，通过PCR验证，探讨Piezo1及Gpx4上下游的关系及两者在髓核组织中精确地调控机制。另一方面，通过尾椎穿刺法模拟机械损伤诱导的椎间盘退变，行X线、MRI及Micro-CT等影像学检查、番红固绿染色、免疫组化和免疫荧光等检测方法，验证髓核细胞铁死亡对于椎间盘退变的影响。<br>　　研究结果:<br>　　(1)椎间盘退变程度与髓核组织铁积聚和铁死亡指标成正相关。过度机械压力刺激可诱导Piezo1蛋白的上调和GPX4蛋白的下调。髓核细胞转录组基因测序结果显示，相较于非加压组，加压组细胞中与铁代谢和铁死亡相关生物标记物的水平出现显著变化(P＜0.01)。随着时间延长，机械压力刺激导致髓核细胞铁过载逐渐加重，在3小时内即可出现统计学差异(P＜0.01)。同时，透射电镜结果显示，机械刺激后的细胞表现出了典型铁死亡的特征，包括线粒体膜增厚变黑、线粒体皱缩和线粒体嵴消失。进一步，体外1MPa压力刺激髓核细胞，细胞形态发生了明显改变，细胞骨架受损，活性下降。过度机械压力可增加细胞内铁和MDA含量，造成细胞内铁代谢紊乱，而Piezo1通道抑制剂和铁死亡抑制剂均可改善细胞铁死亡表型，Piezo1抑制剂效果更为明显。<br>　　(2)利用铁剂柠檬酸铁铵可造成细胞外高铁离子环境，诱发细胞铁死亡。Piezo1的特异性激活可增加铁剂的效应，导致更加严重的线粒体功能受损、膜电位降低及线粒体功能蛋白的改变。Piezo1的药理学抑制可减缓由铁剂导致的细胞内MDA、活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)及脂质过氧化物的产生，且与钙离子是否参与无关。值得注意的是，TFRC作为铁死亡标记物在铁剂组升高，而在Yoda1激动后出现了反常性地降低。在纤维环细胞、成骨细胞及骨髓间充质干细胞中的结果与髓核细胞一致。此外，转铁蛋白受体的敲低可以部分减轻由FAC导致的铁死亡表型，但未有效逆转由机械压力和化学激动导致的铁过载现象。<br>　　(3)通过构建Piezo1椎间盘髓核细胞特异性敲除小鼠(Col2a1-CreERTPiezo1flox/flox)，发现Piezo1的缺失可以减轻由椎间盘穿刺损伤诱导的椎间盘退变。Gpx4的缺失加重了椎间盘退变的程度，同时髓核细胞的合成代谢产物降低，铁死亡相关蛋白表达增多。影像学、组织学分析显Gpx4/Piezo1双敲小鼠中GPX4的额外丢失很大程度上消除了Piezo1条件性敲除小鼠中椎间盘退变的缓解。此外，Piezo1敲除小鼠中Gpx4基因上调(P＜0.01),而Gpx4敲除小鼠中Piezo1基因变化无统计学差异。结果表明，Piezo1是Gpx4的上游信号分子。<br>　　研究结论:<br>　　Piezo1响应机械压力刺激信号介导了髓核细胞的铁代谢紊乱并加重了铁死亡。Piezo1通道的药理学失活显著减少了铁的积累，减轻了线粒体ROS,并抑制了机械压力刺激下的铁死亡改变。重要的是，Piezo1诱导的铁内流与TFRC无关。此外，Piezo1的消融可以减缓机械穿刺诱导的损伤，Gpx4/Piezo1双敲除小鼠比Gpx4敲除表现出更好的恢复水平。Piezo1离子通道是铁内流的潜在决定因素，Piezo1-铁-铁死亡轴可能为治疗机械应力诱导的疾病提供新的治疗线索。