检索历史 清除

摘要研究背景:<br>　　脊髓损伤（Spinalcordinjury,SCI）是由直接或间接因素导致的脊髓组织结构破坏和神经功能障碍。SCI会造成运动和感觉功能的永久丧失，原因在于外部微环境和内部神经生物化学的复杂机制限制了神经元可塑性和轴突再生。首先，成熟神经元无法再生和分裂，且内源性神经干细胞在脊髓中的数量和分布非常有限。其次，脊髓的原发性损伤通常会引发一系列加剧组织缺血和炎症反应的继发性损伤机制，如:兴奋性氨基酸的释放、离子平衡的紊乱、细胞内钙离子超载、线粒体功能障碍以及多种免疫和炎症反应的激活，进而导致神经元和胶质细胞的凋亡。最后，在SCI的后期，形成的神经胶质瘢痕和囊腔作为物理屏障阻碍了轴突再生。因此，SCI通常会导致永久性的神经功能缺失，何以解决这一问题成为当前研究的关键和挑战。<br>　　神经干细胞（Neuralstemcells,NSCs）具有神经再生和神经保护的特性，故而NSCs移植有望促进脊髓受损区域的组织结构和功能恢复。研究表明，NSCs治疗SCI需要趋化因子介导，以促使干细胞定向迁移至损伤组织部位，其中，基质细胞衍生因子-1α（Stromalcell-derivedfactor-1α,SDF-1α）和其特异性受体:趋化因子C-X-C-基元受体4（Chemokine（C-X-C-Motif）receptor4,CXCR4）既可促进干细胞的迁移、增殖和分化，又有助于轴突生长和髓鞘再生。另外，CXCR4和SDF-1α在NSCs中表达，亦可促进NSCs增殖、迁移和神经发生。<br>　　神经营养因子对中枢神经系统（Centralnervoussystem,CNS）的神经元存活、轴突生长和修复的作用已被充分证明。其中，脑源性神经营养因子（Brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF）和胶质源性神经营养因子（Glialcell-derivedneurotrophicfactor,GDNF）在促进SCI的运动轴突生长中起作用。给予外源性神经营养因子，不仅发挥神经保护作用并限制继发性损伤，而且还能促进SCI中轴突再生和髓鞘碱性蛋白的表达。促进SDF-1/CXCR4轴可提高脑组织内GDNF和BDNF等蛋白表达。过表达SDF-1α的NSCs细胞移植能否增强SCI区域BDNF和GDNF等蛋白表达仍不明确。<br>　　本研究将过表达SDF-1α的NSCs细胞移植到脊髓受损区域，在避免SDF-1α于受损部位反复注射的同时，通过多种机制产生促进神经再生、轴突生长和神经营养因子的表达等作用，从而有助于损伤脊髓的恢复。本研究期望为SCI患者运动和感觉功能的恢复提供有效治疗手段，并为相应的临床应用提供切实而充足的理论依据和科学实践。<br>　　研究目的:<br>　　1.阐述SDF-1α对NSCs的作用及潜在机制。<br>　　2.明确过表达SDF-1α对NSCs移植在治疗SC1的作用及分子机制。<br>　　研究方法:<br>　　1.提取海马NSCs,鉴定其标志物的表达及增殖分化能力。<br>　　提取孕14dSD大鼠海马NSCs,免疫荧光鉴定NSCs标志物Nestin的表达，EdU检测细胞增殖能力;分化培养后通过检测GFAP、Olig2和β3-Tubulin的表达，鉴定其分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元的能力。<br>　　2.检测SDF-1α对NSCs增殖、迁移及向神经元分化的影响。<br>　　（1）设置分组:对照组、1ng/mLSDF-1α组、10ng/mLSDF-1α组、100ng/mLSDF-1α组及100ng/mLSDF-1α+AMD3100（100μM/L）组。利用CKK-8法测定在24h、48h、72h,不同浓度SDF-1α对于NSCs增殖的影响及CXCR4特异性抑制剂AMD3100对SDF-1α作用的影响;使用Transwell实验观察SDF-1α以及CXCR4特异性抑制剂AMD3100对NSCs迁移的影响。<br>　　（2）设置分组:对照组、100ng/mLSDF-1α组及100ng/mLSDF-1α+AMD3100（100μM/L）组。镜下观察NSCs的迁徙距离，检测SDF-1α对NSCs水平迁移的作用。各组细胞经分化培养后，使用细胞免疫荧光和WesternBlot检测β3-Tubulin的表达水平，观察SDF-1α对NSCs向神经元分化的影响，以及AMD3100对SDF-1α作用的影响。<br>　　3.构建稳定过表达SDF-1α的NSCs系，观察SDF-1α-NSCs移植对SCI大鼠运动功能恢复的影响。<br>　　（1）构建稳定过表达SDF-1α的NSCs系（SDF-1α-NSCs）:通过慢病毒感染法，将SDF-1α基因导入到NSCs中，使其稳定地过表达SDF-1α。通过Westernblot、ELISA法及RT-qPCR鉴定SDF-1α过表达，以确保成功构建SDF-1α-NSCs系。<br>　　（2）构建SCI大鼠模型:使用改良Allen''s法，损伤大鼠T10节段造成SCI。将实验动物分为:Sham组、PBS组、NC-NSCs移植组、SDF-1α-NSCs移植组及SDF-1α-NSCs+AMD3100移植组等五组。Sham组只暴露于T10节段脊髓，不注射任何药物。PBS组注射6μLPBS到脊髓受损灶。NC-NSCs移植组注射6μL阴性对照的NSCs到损伤部位，总共105个细胞。SDF-1α-NSCs移植组注射6μL过表达SDF-1α的NSCs到损伤部位，总共105个细胞。SDF-1α-NSCs+AMD3100移植组，在SDF-1α-NSCs移植组的基础上，移植术后每日1mg/Kg/d皮下注射AMD3100（1mg/mL）。术后第1、3天和第1、2、3、4周，BBB评分观察大鼠后肢运动能力的恢复进度。<br>　　4.观察SDF-1α-NSCs移植对脊髓组织结构恢复的影响，检测其相关信号通路变化。<br>　　SCI造模术后1个月，每组大鼠随机选取9只，进行脊髓组织取样。对取得的脊髓组织进行石蜡切片，使用HE染色观察损伤部位的恢复进展情况，使用GFP及β3-Tubulin双荧光染色观察各组大鼠脊髓受损灶神经元的变化及NSCs移植情况，使用NF200荧光染色观察各组大鼠脊髓受损灶轴突的再生情况。另随机选取每组大鼠的3只做活体取材，通过Westernblot检测各组GDNF、BDNF、CXCR4、SDF-1α等蛋白的表达变化。<br>　　研究结果:<br>　　1.成功提取海马NSCs,并鉴定其标志物的表达及其增殖分化能力。<br>　　提取的海马NSCs,呈悬浮生长并逐渐聚集成球。细胞免疫荧光提示所提细胞Nestin表达阳性，大部分细胞EdU染色阳性，经NSCs分化培养基诱导分化后，经检测分别有GFAP、GALC和β3-Tubulin表达阳性的细胞。证明分离培养的原代细胞为NSCs,在具有增殖能力的同时，还可分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。<br>　　2.SDF-1α可促进NSCs增殖、迁移及向神经元分化的能力。<br>　　（1）通过CCK8实验发现:1ng/mLSDF-1α组、10ng/mLSDF-1α组、100ng/mLSDF-1α组在450nm处OD值明显高于对照组（P＜0.05）,100ng/mLSDF-1α+AMD3100组OD值较100ng/mLSDF-1α组明显下降（P＜0.05）。表明SDF-1α可促进NSCs的增殖，且与浓度有关:浓度越大，促进能力越强。使用Transwell法，在荧光显微镜下观察迁移情况，发现1ng/mLSDF-1α组、10ng/mLSDF-1α组、100ng/mLSDF-1α组细胞迁移数量较对照组逐一增加（P＜0.05）,100ng/mLSDF-1α+AMD3100组较100ng/mLSDF-1α组细胞迁移数量减少（P＜0.05）,表明SDF-1α能够促进NCSs的增殖迁移，而AMD3100可对其产生抑制。<br>　　（2）在水平迁移实验中，100ng/mLSDF-1α组NSCs的迁徙距离明显长于对照组（P＜0.05），且100ng/mLSDF-1α+AMD3100组迁徙距离较100ng/mLSDF-1α组明显缩短（P＜0.05），表明SDF-1α能够促进NCSs的水平迁移。各组细胞经分化培养后，通过细胞免疫荧光及WesternBlot等实验，发现100ng/mLSDF-1α组β3-Tubulin阳性细胞比例及的β3-Tubulin蛋白表达水平明显高于对照组（P＜0.05），加入AMD3100后迁移距离明显缩短（P＜0.05）。证明了SDF-1α可促进NCSs的水平迁移及向神经元的分化能力，且AMD3100可对其产生抑制。<br>　　3.成功构建SDF-1α-NSCs,SDF-1α-NSCs移植促进SCI大鼠的运动功能恢复。<br>　　（1）成功构建稳定过表达SDF-1α的NSCs系（SDF-1α-NSCs）及其阴性对照（NC-NSCs）。<br>　　（2）成功构建SCI大鼠模型，在NSCs移植术后第28天，NC-NSCs移植组、SDF-1α-NSCs移植组及SDF-1α-NSCs+AMD3100移植组的BBB分值均高于PBS组（P＜0.05），且SDF-1α-NSCs移植组的BBB分值高于NC-NSCs移植组和SDF-1α-NSCs+AMD3100移植组（P＜0.05）,同时SDF-1α-NSCs+AMD3100移植组高于NC-NSCs移植组（P＜0.05）。表明SDF-1α可促进SCI大鼠双后肢运动能力的恢复，且AMD3100可抑制这一作用。<br>　　4.SDF-1α-NSCs移植促进脊髓组织结构恢复，且可能与促进SDF-1α/CXCR4轴有关。<br>　　（1）在组织HE染色中，NC-NSCs移植组、SDF-1α-NSCs移植组及SDF-1α-NSCs+AMD3100移植组的脊髓组织空洞均小于PBS组（P＜0.05），且SDF-1α-NSCs移植组的空洞面积小于NC-NSCs移植组和SDF-1α-NSCs+AMD3100移植组（P＜0.05）,同时SDF-1α-NSCs+AMD3100移植组高于NC-NSCs移植组（P＜0.05）。提示SDF-1α可促进SCI大鼠的脊髓组织结构恢复，且AMD3100可部分抑制这一作用。<br>　　（2）在脊髓组织GFP及β3-Tubulin双荧光染色中，SCI区域β3-Tubulin阳性及GFP和β3-Tubulin双阳性的细胞数目，在PBS组、NC-NSCs移植组、SDF-1α-NSCs+AMD3100移植组及SDF-1α-NSCs移植组中依次增多（P＜0.05）。在脊髓组织NF200荧光染色中，PBS组和NC-NSC组脊髓受损部位只有少量不连贯的NF200阳性轴突纤维，表明在这些受损部位轴突生长和再生受到了限制。而SDF-1α-NSCs组脊髓受损部位可见大量的NF200阳性轴突纤维，连续注射AMD3100后，轴突再生较之减少。再一次说明细胞移植成功，SDF-1α可促进NSCs移植治疗SCI的轴突及神经元的再生作用，且AMD3100可部分抑制这一能力。<br>　　（3）在各组大鼠SCI区域的WesternBlot检测中，与PBS组相比，CXCR4的蛋白表达水平在NC-NSCs移植组及SDF-1α-NSCs移植组中依次增多，而在SDF-1α-NSCs+AMD3100移植组显著降低（P＜0.05）。对于GDNF、BDNF、SDF-1α的蛋白表达水平而言，与PBS组相比，则是在NC-NSCs移植组、SDF-1α-NSCs+AMD3100移植组及SDF-1α-NSCs移植组中依次增多，SDF-1α-NSCs+AMD3100移植组仍高于NC-NSCs移植组（P＜0.05）。由此可见，过表达SDF-1α的NSCs移植可促进脊髓组织GDNF、BDNF等蛋白的表达，且AMD3100可部分抑制其作用。<br>　　研究结论:<br>　　1.SDF-1α可通过激活CXCR4受体促进NSCs的增殖、迁移及向神经元分化。<br>　　2.过表达SDF-1α的NSCs移植治疗能促进SCI大鼠运动功能恢复、神经元发生、组织结构改善，且该过程可能与促进SDF-1α/CXCR4轴有关。