检索历史 清除

摘要研究目的:<br>　　乳腺癌是女性最常见的癌症之一，是女性癌症死亡的第二大原因，探究乳腺癌发生进展的分子机制至关重要。circRNA作为一种是新兴的单链RNA，由于其能抵抗RNA酶的降解而比较稳定，有望成为新的生物标记物。circRNA的作用机制复杂，包括作为内源竞争性RNA（ceRNA）起到miRNA“海绵”作用、调控基因转录、与蛋白相互作用、参与蛋白质翻译等。本研究在临床样本检测乳腺癌中circ_0005379的表达，明确其诊断价值;通过体内外实验明确其在乳腺癌中的功能，通过circRNA与结合蛋白互作方式阐明其促进乳腺癌发展的分子机制。<br>　　研究方法:<br>　　1.在3对配对的人乳腺癌和癌旁组织中进行全转录组测序筛选差异表达的circRNA,后续在11对配对的乳腺癌及癌旁组织中使用实时定量PCR验证候选circRNA的差异表达，进行ROC曲线分析，探究其诊断价值。并分析126例乳腺癌患者中circ_0005379表达量与乳腺癌患者临床病理参数的关系。<br>　　2.构建circ_0005379慢病毒过表达、shRNA干扰载体，进行细胞功能研究，检测circ_0005379在体外对乳腺癌细胞增殖、凋亡、周期、迁移浸润的影响。进行裸鼠动物实验，探究circ_0005379在体内对肿瘤生长及远处转移的作用。<br>　　3.使用荧光原位杂交技术确定circ_0005379的细胞内定位，RNA下拉实验、蛋白质谱寻找circ_0005379的潜在结合蛋白，使用RNA结合蛋白免疫沉淀、western blot等实验证明circ_0005379与RNA结合蛋白直接结合及circ_0005379调控RNA结合蛋白的分子机制。<br>　　研究结果:<br>　　1.通过全转录组测序在3对配对的乳腺癌和癌旁组织中筛选了异常表达的circRNA,在11对配对的乳腺癌及癌旁组织中行实时定量PCR证实circ_0005379在乳腺癌中表达上调。circ_0005379对乳腺癌及癌旁具有较好的区分能力，其在肿瘤直径大（P=0.0016）、有淋巴结转移（P=0.0256）、HER2 阳性（P=0.0447）、ki-67 高表达（P=0.0450）、HER2阳性分型（P=0.0416）、分期较晚（P＜0.0001）的乳腺癌组织中表达更高。<br>　　2.体外细胞学实验证实circ_0005379过表达可促进乳腺癌细胞的增殖、迁移浸润，抑制细胞凋亡，而下调circ_0005379可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移浸润，促进细胞凋亡。裸鼠体内成瘤实验发现circ_0005379可以促进乳腺癌生长、转移。<br>　　3.荧光原位杂交发现circ_0005379在细胞质及细胞核中均有分布。RNA pull-dowm、蛋白质谱、RNA结合蛋白免疫沉淀、western blot发现并验证circ_0005379可直接结合ANXA2蛋白并上调 ANXA2,促进STAT3、p-STAT3的表达。Western blot发现circ_0005379可部分逆转泛素化相关分子UBAP2和TRIM65介导的ANXA2下调。<br>　　研究结论:<br>　　circ_0005379在乳腺癌组织较癌旁组织表达升高，在乳腺癌组织中其高表达与乳腺癌肿瘤直径大、腋窝淋巴结转移阳性、分期晚、HER2表达阳性、ki-67表达高相关。circ_0005379促进体外乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡，在体内加速肿瘤生长和转移。circ_0005379结合并上调ANXA2,可能是通过阻断UBAP2和TRIM65介导的ANXA2泛素化，从而上调STAT3,促进乳腺癌的进展。