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摘要研究背景:<br>　　多发性硬化（Multiple sclerosis，MS）是一种累及中枢神经系统（Central nervous system,CNS）的自身免疫性脱髓鞘疾病，也是导致年轻人非创伤性残疾最常见的原因。目前美国食品和药品监督管理局（Food and drug administration,FDA）批准的药物，虽然在一定程度上可缓解疾病发作，但这些药物难以跨越血脑屏障（Blood-brain barrier，BBB）、无法直接调控中枢免疫细胞，导致MS无法治愈，病情持续隐匿进展，最终导致患者永久性残疾。尽管MS发病机制不明，但浸润CNS的活化自反应T细胞被认为在MS启动及疾病进展中起着核心致病作用，其攻击自身髓鞘，并分泌大量炎性细胞因子及趋化因子，激活小胶质细胞，进一步招募外周T细胞及巨噬细胞，加剧神经炎症，导致CNS免疫失调。因此探索跨BBB、及时清除CNS致病自反应T细胞并终止级联炎症反应的方法，对重塑脑免疫稳态并提高预后至关重要。<br>　　基于此，本文构建了经鼻递送跨BBB、包载双mRNA即 MOG（MS自身抗原）和Fasl（凋亡配体）的乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）功能化的脂质胸腺嘧啶纳米粒（LF-LTNPs-MOG-Fasl,缩写LF-LMF）。LF-LMF进入CNS后可靶向并编辑小胶质/巨噬细胞（Microglia/Macrophages，Ms），原位生成“诱捕杀手” Ms，其通过编辑Ms表达“诱饵” MOG来诱捕MOG特异性T细胞并通过表达“杀手” Fasl触发Fas介导的凋亡，从而特异性清除抗原特异性T细胞，并触发一系列免疫抑制反应，重塑脑免疫稳态，抑制MS进展，并通过MR增强成像精准评估治疗效果。<br>　　研究目的:<br>　　探究经鼻递送LF功能化的脂质胸腺嘧啶纳米粒LF-LMF在跨BBB、及时清除CNS致病自反应T细胞以终止炎症级联反应及重塑脑免疫稳态方面的治疗作用并通过MR增强成像评估LF-LMF治疗效果。<br>　　研究方法:<br>　　1、LF-LMF的制备及表征:通过微流控设备合成LF修饰及未修饰的脂质胸腺嘧啶纳米粒 LF-LMF 和 LMF;通过透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）、马尔文粒径仪测定LF-LMF及LMF形态、粒径和Zeta电位，并对包封率及稳定性进行考察;SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色考察LF修饰率;CCK8实验评估LF-LMF细胞毒性。<br>　　2、LF-LMF 体外功能评价:共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）及流式细胞术检测M0、M1、M2和人支气管上皮细胞系16HBE14o-cells对LF-LMF和LMF的摄取;流式细胞术检测LF受体的表达;CLSM检测mRNA溶酶体逃逸情况;流式细胞术检测mRNA（MOG和Fasl）在M1细胞内的转染;转染的各组M1细胞与MOG特异性T细胞共孵育后，通过AnnexinV-PI法检测MOG特异性T细胞凋亡;通过免疫荧光染色及流式细胞术检测转染的各组M1细胞在诱导MOG特异性T细胞凋亡后，自身向M2抗炎表型转化情况以及活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的水平，通过酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法检测各组促炎及抗炎细胞因子的分泌情况。<br>　　3、LF-LMF体内分布、mRNA表达及安全性评价:构建实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）小鼠模型，将 DIR 标记的 LF-LMF和LMF经鼻腔给药，行EAE小鼠活体及离体器官荧光成像观察在体分布;分离EAE小鼠小胶质/巨噬细胞，通过流式细胞术检测MOG和Fasl的在体表达;野生型（Wild type,WT）小鼠经鼻给药LF-LMF后行体重监测，并于30天后取外周血进行谷氨酸-丙酮酸转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase,AST）、尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）及主要脏器苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin，H&E）染色评估器官毒性。<br>　　4、LF-LMF对EAE疗效的MRI评估及机制研究:EAE小鼠体内治疗后，每天进行临床评分及体重评估，并于免疫诱导第15天，通过尾静脉注射造影剂二乙三胺五醋酸钆（Gadopentetic acid,Gd-DTPA），行MR平扫及增强成像，通过勾画增强区域、计算强化病灶体积评估治疗效果，并通过伪彩图像直观显示病变;于治疗终点行转棒实验评估治疗后运动平衡能力;通过对脑和脊髓组织行劳克坚牢蓝（Luxol Fast Blue,LFB）染色、H&E染色及免疫组化检测治疗后脱髓鞘、炎性细胞浸润及小胶质细胞活化情况;通过流式细胞术检测脊髓内MOG特异性T细胞数量及调节T细胞（Regulatory T cells,Tregs）数量;ELISA检测各治疗组促炎细胞因子和抗炎细胞因子的分泌。免疫组化、免疫荧光及流式细胞术检测各治疗组小胶质/巨噬细胞向M2抗炎表型转化情况。尼氏染色评估治疗后神经元状态;髓磷脂碱性蛋白（Myelin basic protein，MBP）和髓鞘蛋白脂蛋白（Proteolipid protein，PLP）的免疫组化评估髓鞘再生情况。<br>　　研究结果:<br>　　1、LF-LMF及LMF均带负电并呈均一、类球形结构，纳米粒径分别为131.4 ± 1.6 nm和115.9 ± 3.9 nm,包封率分别约为86％和81％,LF修饰率为15.2％，体外稳定性良好，无明显细胞毒性。<br>　　2、M1及16HBE14o-cells高表达LF受体LRP1,特异性靶向摄取LF-LMF,M1细胞对LF-MF摄取的平均荧光强度是LMF的2.2倍。mRNA逃逸溶酶体后进入胞质，MOG和Fasl的体外转染效率分别为35.3％和34.5％。转染Fasl的M1Fasl组（27.68％ ± 2.75％）和同时转染MOG和Fasl的M1MOG+Fasl组（33.30％ ± 1.64％）MOG特异性T细胞的凋亡率显著增加。免疫染色显示M1MOG+Fasl处理组可显著促进M2表型转化及降低ROS的水平;流式细胞术定量检测显示M1MOG+Fasl处理组相比对照组，M2巨噬细胞比例从12.8％上升到74.9％,M1巨噬细胞比例从58.5％下降到22.1 ％,ROS水平由65.4％下降到27.2％,均与M2诱导组水平相当，且该组炎症细胞因子（TNF-α和IL-6）显著减少，而抗炎细胞因子（IL-10和TGF-β）显著增加。<br>　　3、小动物荧光成像显示LF-LMF治疗组荧光信号主要分布在脑和脊髓，而未经LF修饰的LMF治疗组，脑和脊髓内未检测到明显荧光信号。MOG和Fasl在体表达效率分别为15.0％和13.1％。通过血清学、体重监测及H&E染色证实LF-LMF对 WT鼠无明显器官毒性。<br>　　4、体内治疗PBS及其他各治疗组小鼠病情进展明显、体重下降，LF-LMF治疗组的小鼠临床症状明显减轻;转棒实验证实LF-LMF有效改善小鼠运动平衡能力。MR增强成像显示LF-LMF治疗组脑病变体积（0.00367 ± 0.00062）相比PBS组（0.06085 ±0.00528）明显减少，伪彩图像可直观清晰显示病变分布及负荷。LFB、H&E及免疫组化检测证实LF-LMF治疗后脱髓鞘、炎性细胞浸润及活化的小胶质/巨噬细胞明显减少，有效改善了神经炎症。流式细胞术及免疫组化显示，与其他各治疗组相比，LF-LMF治疗组脊髓内致病的MOG特异性T细胞数量明显减少、Tregs增多。ELISA检测表明LF-LMF治疗组降低促炎细胞因子表达并促进抗炎细胞因子分泌。免疫组化及免疫荧光显示脊髓内抗炎小胶质/巨噬细胞（Ms）明显增多;流式细胞术定量检测显示，LF-LMF处理组激活的Ms数量从11.9％下降到4.59％,而抗炎的Ms数量从11.5％增加到42.9％。神经元尼氏染色及髓磷脂碱性蛋白（MBP）和髓鞘蛋白脂蛋白（PLP）免疫组化显示LF-LMF处理组小鼠脊髓中Nissl体数量及MBP和PLP的表达均显著增加。<br>　　研究结论:<br>　　本研究成功构建了LF功能化的脂质胸腺嘧啶纳米粒LF-LMF,经鼻递送绕过BBB有效进入CNS，靶向编辑小胶质/巨噬细胞（Ms），生成“诱捕杀手” Ms，特异性清除致病T细胞，增加Tregs和抗炎Ms数量，并促进受损CNS组织中的神经元增殖和髓鞘再生，协同重塑大脑免疫稳态，有效抑制疾病进展;MR增强成像精准评估疗效并通过伪彩图像直观显示病变。