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摘要甲氧基化是植物中许多次生代谢产物普遍存在的一种修饰方式，常见的甲氧基化修饰针对的底物包括黄酮类、二苯乙烯类、联苯类和联苄类等等。近年来，这些植物特异性的甲基化修饰使得生成的甲氧基化合物获得了更好的药理活性和生物利用度。其中，多甲氧基化联苄（polymethoxylated bibenzyls,PMBs）由于结构新颖、类型多样，药理活性显著逐渐被研究者们所关注。从化学结构上来看，PMBs的母核由两个苯甲基单元通过甲基的C-C键连接而成，在母核上往往具有两个及两个以上的甲氧基取代以满足次生代谢产物复杂的结构特征。利用化学方法合成时，甲氧基化修饰往往没有位点选择性，而合成生物学方法可以完成底物特异及位点特异的氧甲基化反应以满足多种需要。<br>　　以一种常见的多甲氧基化联苄为例，毛兰素（erianin）天然存在于铁皮石斛（Dendrobium catenatum）中，作为一种有应用前景的化合物，它的抗癌活性越来越受到关注。此外，moscatilin、crepidatin、chrysotoxine和chrysotobibenzyl也是石斛中常见的PMBs,它们具有多种药理作用，如抗肿瘤、抗炎和神经保护作用。然而，铁皮石斛PMBs生物合成过程中的甲基化顺序问题尚未解决，需要对参与这些过程的关键酶进行深入研究，以揭示生物合成的复杂网络。因此，本研究选择富含PMBs的植物铁皮石斛为研究对象，结合转录组数据挖掘，分子生物学技术，克隆并异源表达了铁皮石斛中的联苄合酶、联苄氧甲基转移酶和候选的联苄4位羟化酶，通过酶活实验表征重组蛋白的功能和催化规律。<br>　　1.铁皮石斛中联苄合酶基因的克隆与功能鉴定<br>　　联苄合酶（Bibenzyl synthases,BBSs）是一种Ⅲ型聚酮合酶，可催化初始底物二氢咖啡酰辅酶A与三分子丙二酰辅酶A缩合生成线性四酮。随后，通过分子内C7/C2羟醛缩合使环闭合，生成二氢白皮杉醇（化合物1）。本课题从铁皮石斛转录组数据中挖掘到3个候选的联苄合酶基因。系统发育关系上看，DcBBS-like1和DcBBS-like2属于联苄合酶家族分支，DcBBS-like3属于查尔酮合酶家族分支。进一步的功能表征显示，DcBBS-like1具有联苄合酶的功能，将它命名为DcBBS;DcBBS-like3具有查尔酮合酶的功能，将它命名为DcCHS。基于同源模拟和底物对接，我们对DcBBS1进行了5个位点的突变，获得了1个成功的突变体DcBBS1（T211G）,它能够显著提高联苄产物的产量，并降低副产物的产量。此外，还获得了1个仅能产生副产物的DcBBS1（A266F）突变体。对接模型显示，底物结合口袋的大小对缩合丙二酰辅酶A的数量有很大影响。<br>　　2.铁皮石斛中联苄氧甲基转移酶的克隆与功能鉴定<br>　　为了阐明PMBs的甲基化机制，我们实验室前期建立了一个含有18个不同氧甲基、羟基取代特征的联苄底物库。通过代谢指导的氧甲基转移酶的挖掘方法，我们锚定了在根中高表达的9条候选氧甲基转移酶（O-methyltransferases,OMTs）进行克隆和异源表达，成功获得了7个能够正常表达的蛋白。以化合物1开始，选择最优的底物和最大转化率的酶进行组合，解析了毛兰素（5a）和异毛兰素（5b）的生物合成途径。对酶活结果的规律总结表明，DcOMT1,DcOMT2和DcOMT4倾向于对有邻二酚羟基取代的联苄进行甲基化，以分别实现间位（DcOMT1和DcOMT4）和对位羟基（DcOMT2）的甲氧基取代。DcOMT3倾向于选择联苄间二酚羟基（3/5位）的其中一个羟基进行氧甲基化修饰，DcOMT6和DcOMT3的选择性类似，但转化率不及DcOMT3;DcOMT5倾向于选择对位取代，对3''-OCH3取代的苯环的4''-OH选择性很高。此外，我们还通过底物-蛋白对接分析，探究了DcOMTs催化位点选择性的结构基础。最后，我们扩展了底物的范围，利用无细胞正交实验的办法，揭示了铁皮石斛中一个更加全面复杂的PMBs生物合成网络，并为根据DcOMTs的底物选择性优势设计OMT组合提供了方法指导。<br>　　3.铁皮石斛中联苄4位羟化酶的克隆与功能鉴定<br>　　本章从铁皮石斛中挖掘到4个可能的联苄4位羟化酶基因，期望能够补充联苄4位羟化酶目前的研究空白，完善PMBs的生物合成途径。通过序列分析发现这4个酶都具有K螺旋、PERF基序和Heme结合域等保守的CYP450特征序列。于是我们从铁皮石斛中克隆并用酵母WAT11异源表达了DcB4H-like1-4和为其发挥电子传递作用的DcCPRs,没有能够检测到与阴性对照有明显差异的联苄4位羟基化功能。利用烟草进行的毛兰素与异毛兰素的生物合成重构实验也没能检测到相应的代谢产物。后续的实验将尝试从外界胁迫的角度展开，看能否对参与联苄4位羟基化的羟化酶的基因进行激活，从而使它们能更好的被捕捉到。<br>　　本研究首次从兰科植物铁皮石斛中鉴定了1个联苄合酶（DcBBS）、1个查尔酮合酶（DcCHS）和6个联苄氧甲基转移酶（DcOMTs），初步探究了铁皮石斛中以毛兰素为代表的PMBs生物合成途径中的关键甲基化过程，不仅为揭示PMBs的完整生物合成机制提供了坚实的基础，更为PMBs在合成生物学领域深入的研究提供了有力的候选。