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摘要三阴性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌(BC)中最具侵袭性的亚型，局部复发和远处转移的风险较高，预后较其他亚型差。由于缺乏治疗靶点、更高的侵袭性、异质性和化疗抵抗，在过去的20年里细胞毒性化疗仍然是早期和晚期TNBC的主要治疗选择。近十年来，TNBC的治疗虽然取得了令人瞩目的进展，包括免疫检查点抑制剂(ICIS)、PARP抑制剂、抗体药物偶联物(ADC)和其他有希望的药物的组合。然而，不到20％的TNBC患者携带生殖细胞系BRCA1/2突变，只有40％的TNBC肿瘤细胞和肿瘤相关免疫细胞表达PD-L1。因此，大多数TNBC患者不能从这些策略中获益，有必要进一步探索TNBC进展的潜在机制，确定新的治疗靶点，以提高抗肿瘤治疗效果和改善患者生存。<br>　　免疫球蛋白样转录子4(ILT4)是新确立的免疫检查点分子。它生理上主要表达在固有免疫细胞上，代表它们的免疫抑制表型。当与相应配体结合时，ILT4通过免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)/丝氨酸同源性蛋白(SHP)-1或SHP-2轴向细胞内传递抑制信号。它负性调节树突状细胞(DC)的抗原呈递，中性粒细胞的吞噬，巨噬细胞的成熟和血小板的聚集，诱导巨噬细胞向M2样极化、T细胞向Th2型分化，维持免疫抑制微环境。ILT4在小鼠中的同源物是配对免疫球蛋白样受体B(PIR-B)。近十年来，我们和其他研究团队发现，ILT4和PIR-B在肺癌、食管癌、胰腺癌等实体肿瘤中富集。肿瘤来源的ILT4通过促进肿瘤细胞增殖和侵袭直接促进肿瘤进展，或通过创建免疫抑制性肿瘤微环境(TME)间接促进肿瘤进展。但ILT4在TNBC中的表达及作用机制尚不明确。<br>　　研究目的:<br>　　本研究将首先明确ILT4在TNBC中的表达水平及其与患者预后关系;其次探索ILT4对TNBC细胞增殖、侵袭、迁移等恶性生物学行为的影响;之后揭示ILT4调控TNBC细胞生物学行为的代谢机制及分子信号通路;最后探索ILT4作为潜在靶点对TNBC的治疗价值。<br>　　研究方法:<br>　　1.第一部分:ILT4在TNBC的表达及临床意义<br>　　1)通过在线数据库Ualcan及临床患者队列研究ILT4在正常组织和不同分子亚型BC组织中的表达，并分析ILT4表达水平和TNBC患者临床病理参数及生存之间的相关性;<br>　　2)通过RT-qPCR、Western blot技术检测ILT4/PIR-B(ILT4在小鼠中的同源分子)在人和小鼠TNBC细胞系中的表达;<br>　　2.第二部分:ILT4对TNBC生物学行为的调控及其分子机制<br>　　1)通过转染技术建立ILT4/PIR-B过表达/敲低的TNBC稳转株，通过EdU、CCK-8、Transwell等实验评价ILT4/PIR-B对肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移等恶性生物学行为的影响;<br>　　2)通过RT-qPCR、Western blot、葡萄糖摄取实验、乳酸生成实验研究ILT4/PIR-B对糖代谢酶及代谢产物、代谢相关分子信号通路蛋白的影响;<br>　　3)通过应用糖代谢/信号通路抑制剂，明确ILT4是否通过调控糖代谢、信号通路蛋白诱导TNBC恶性生物学行为;<br>　　3.第三部分:PIR-B在体内促进TNBC进展和糖酵解<br>　　构建小鼠TNBC移植瘤和转移瘤模型，体内验证ILT4阻断对肿瘤生长、糖代谢及代谢相关信号通路蛋白的调控。<br>　　研究结果:<br>　　1.第一部分:ILT4在TNBC的表达及临床意义<br>　　1)ILT4在人TNBC组织中的表达高于正常组织及其他分子亚型;<br>　　2)ILT4在人TNBC细胞系中的表达高于正常乳腺细胞系;<br>　　3)高的ILT4表达与患者较晚的TNM分期、临床分期和较差的OS正相关。<br>　　2.第二部分:ILT4/PIR-B调控TNBC恶性生物学行为及分子机制<br>　　1)ILT4/PIR-B促进TNBC细胞增殖、侵袭、迁移<br>　　过表达ILT4/PIR-B显著提高TNBC细胞的增殖、侵袭、迁移能力，而敲低ILT4/PIR-B 则反之。<br>　　2)ILT4/PIR-B通过调控糖酵解过程诱导TNBC细胞恶性生物学行为<br>　　过表达ILT4/PIR-B上调葡萄糖转运体3(GLUT3)和丙酮酸激酶-M2(PKM2)基因表达，促进葡萄糖摄取和乳酸生成;敲低ILT4/PIR-B则反之。葡萄糖转运体(GLUT)抑制剂KL-11743或PKM2抑制剂化合物3k逆转了 ILT4/PIR-B过表达上调的TNBC细胞糖代谢和恶性行为。<br>　　3)ILT4/PIR-B通过激活AKT/mTOR信号通路调控TNBC细胞糖代谢和恶性行为<br>　　过表达ILT4/PIR-B上调了通路蛋白AKT、mTOR和ERK 1/2的磷酸化。AKT抑制剂MK2206或mTOR抑制剂雷帕霉素，而不是ERK 1/2抑制剂U0126,逆转了 ILT4/PIR-B上调的糖代谢和恶性行为。<br>　　3.第三部分:PIR-B在体内促进TNBC的进展和糖酵解<br>　　过表达PIR-B在体内促进C57BL/6J小鼠TNBC的生长和转移。敲低PIR-B则显示出良好的抗肿瘤活性。过表达PIR-B上调了 TNBC组织中GLUT3和PKM2的表达，敲低PIR-B则反之。<br>　　研究结论:<br>　　1.ILT4在TNBC中高表达，并预示较晚的分期和不良预后。<br>　　2.ILT4在体外促进 TNBC细胞的增殖、迁移和侵袭。<br>　　3.在机制上，ILT4激活AKT/mTOR信号通路，进而诱导GLUT3和PKM2这两个糖酵解关键酶的表达，最终促进肿瘤细胞糖酵解过程。<br>　　4.ILT4在体内促进肿瘤生长、转移，抑制ILT4显示良好的抗肿瘤活性。