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摘要人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HumanimmunodeficiencyvirustypeⅠ，HIV-1)是导致艾滋病感染的主要病原体，对人类健康和社会发展造成严重威胁。现有的联合抗逆转录病毒疗法尽管能够有效降低死亡率并改善患者生存质量，但由于HIV-1的潜伏性，该疗法目前无法完全清除患者体内的病毒，因此艾滋病人需要终身接受治疗，这不可避免地引发了严重的耐药性和毒副作用等问题。因此，基于HIV-1潜在新靶标，研发新结构、新作用机制的抗艾滋病药物具有重要意义。<br>　　衣壳蛋白(Capsid,CA)是构成成熟且有感染性的HIV-1颗粒所必需的结构蛋白，在病毒复制早期和晚期的多个环节均发挥重要的调控作用。因此，CA已成为抗HIV-1药物开发的一个非常有前景的靶点。NTD-CTD界面相互作用促使CA单体形成五聚体和六聚体，且干扰HIV-1复制的多个宿主因子均靶向于该界面，因此，NTD-CTD结合口袋成为设计HIV-1CA调控剂最受关注的作用位点，已成功开发出多个靶向该位点的候选小分子。PF74是首个被报道的靶向该界面的CA调控剂，由于抗病毒活性差(MT4细胞系HIV-1NL4-3病毒株:EC50=0.63μM)和存在耐药性(Q67H、K70R、H87P、T107N和L111I)的缺陷，未能得到进一步研究。Lenacapavir(LEN)是被批准上市的首个HIV-1衣壳蛋白调控剂，具有皮摩尔级的抗病毒活性和优异的代谢稳定性，但该药物在临床实验和体外筛选中均出现了多种对其不敏感的CA耐药株(M66I、Q67H、K70R、N74D等)。因此，针对衣壳蛋白靶标探索新型HIV-1衣壳蛋白调控剂具有重要的研究价值和科学意义。<br>　　本论文针对现有HIV-1CA调控剂存在的耐药性缺陷，进行了蛋白降解新机制和CA结合新位点两方面的研究工作:<br>　　基于疏水标签技术的新型HIV-1衣壳蛋白降解剂的设计、合成与生物活性评价<br>　　靶向蛋白降解(Targetedproteindegradation，TPD)利用细胞内源降解机制实验高效降解致病蛋白，与传统调控剂相比，在克服耐药性方面优势显著，因此，本研究将TPD策略应用于衣壳靶标以期发现具备全新作用机制的抗艾滋病抗耐药性药物。疏水标签(Hydrophobictag，HyT)作为一种方兴未艾的TPD技术，已经在PDEδ、ALK以及EZH2等多个目标蛋白实现成功降解，如。本课题组前期发现了一个苯丙氨酸类HIV-1衣壳蛋白调控剂11L，具有低微摩尔水平的抗病毒活性(MT-4细胞，HIV-1ⅢB病毒株:EC50=0.21μM)，进一步的结构生物学揭示了该分子与CA六聚体内相邻亚基间NTD-CTD界面的结合模式。基于以上分析，我们以11L为先导化合物，从位于溶剂暴露区的苯磺酰胺对位引入2至6个碳原子的烷基Linker,再与金刚烷、2,2-二环已基和降冰片烯等疏水片段相连，共设计合成了47个新型HIV-1CA疏水标签分子及其对应的阴性对照。<br>　　我们对目标化合物进行了MT4细胞中抗HIV-1NL4-3和抗HIV-1ⅢB活性和毒性测试，结果表明大多数化合物均具有不同程度的抗病毒作用(HIV-1NL4-3:EC50=29.33-0.18μM;HIV-1ⅢB:EC50=131.71-0.41μM)和较低的细胞毒性(CC50＞50μM)，其中，以-CO(CH2)3NH-为Linker的HyTs金刚烷类H7(HIV-1NL4-3:EC50=0.21μM;HIV-1ⅢB:EC50=0.41μM)和降冰片烯类H27(EC50=0.18μM;HIV-1ⅢB:EC50=0.68μM)活性最好，与11L活性相当(HIV-1NL4-3:EC50=0.11μM;HIV-1ⅢB:EC50=0.88μM)。有趣的是，与H7结构类似，仅在先导11L与Linker之间的酰胺键方向上反转的衍生物H17，其抗病毒活性下降了10倍(HIV-1NL4-3:EC50=2.17μM)，出现了一定程度的“活性悬崖”现象，该现象表明反转的酰胺键不利于与靶标的结合。另外，疏水标签分子表现出比其阴性对照更强的抗病毒活性，且有双氟取代的化合物明显优于无氟取代。综上考虑，我们选择活性最好的HyTsH7和H27进行进一步的机制验证。<br>　　表面等离子共振(Surfaceplasmonresonance，SPR)实验结果显示，H7对衣壳蛋白六聚体的亲和力(KD=1.65μM)是11L(KD=4.44μM)的2.7倍，对单体的亲和力(KD=2.09μM)与11L(KD=2.33μM)相当，这说明与11L相比，H7与CA六聚体和单体结合的亲和力均有所提升，其中与六聚体亲和力的提升更为显著。值得注意的是，H27没有获得SPR数据，我们分析可能是由于降冰片烯基团对芯片产生了破坏，因此后续以H7为代表化合物进行探究。单轮感染实验显示，H7在HIV-1生命周期的早期和晚期阶段均能干扰病毒复制，其中早期感染阶段效果更佳。进一步的ELISA降解机制验证实验表明，HyTH7是一种呈现时间依赖性的HIV-1衣壳蛋白降解剂，并且通过蛋白酶体途径发挥降解CA作用。最后，蛋白水平体外自组装和解离实验显示，H7能够很好地与Q67H、K70R和N74D作用，这表明该化合物具有一定的抗耐药性潜力。此外，对于11L与Linker之间酰胺键方向存在的“活性悬崖”现象，我们通过分子动力学模拟计算了H7和H17对衣壳蛋白稳定性的影响，从而分析得出化合物H17活性较H7降低的可能因素。<br>　　靶向HIV-1衣壳蛋白六聚体中心孔的苗头化合物发现<br>　　CA六聚体中心孔在早期阶段能够募集核苷酸导入病毒颗粒，从而促进衣壳内DNA的合成;在晚期阶段则与IP6相互作用从而使衣壳组装成成熟病毒颗粒。若小分子占据了该位点，则会抑制核苷酸导入，进而有效地阻断HIV-1衣壳内逆转录，同时干扰CA晶格的形成。因此，将六聚体中心孔作为抗病毒药物设计的新位点具有重要的研究价值。结构生物学研究表明，R18和K25是该位点发挥正常生理功能最为关键的氨基酸，因此本研究采用锚定R18和K25氨基酸法，从ChemDiv、V1TAS-M和CHEMBRIDGE三个商业化合物库中进行了分子对接和高通量虚拟筛选，通过综合对接打分顺序和目视比对，进而挑选出了具有合理结合模式且得分较高的16个待测小分子。我们采用SPR对这些化合物进行了与衣壳蛋白六聚体和单体的亲和力测试，结果表明，2-硫代-2,4-噻唑烷二酮类ZA-15与六聚体具有微摩尔级结合力(KD=19.6μM)，是一个结构全新的苗头化合物。单轮感染结果显示，ZA-15在20μM下有效抑制U87.CD4.CCR5细胞HIV-1早期感染，而晚期阶段则无作用。我们随后对ZA-15(Infectivity％=28.45)进行结构优化，从而提高其抗病毒活性，最终发现了10μM初筛浓度下抗病毒活性提升6.2倍的噻唑烷二酮类ZA-30(Infectivity％=3.72)。<br>　　综上所述，本论文针对HIV-1衣壳蛋白调控剂存在的耐药性问题，一方面从基于新机制—疏水标签降解剂入手，在结构生物学信息的指导下，设计并合成了共计47个含2-哌嗪酮的HIV-1CA疏水标签分子及其阴性对照，经细胞水平活性和毒性测试、以及SPR、降解机制验证实验等多方面考察，发现了一个具有降解CA作用且呈时间依赖性的H7;另一方面，本论文从开发HIV-1CA新位点—六聚体中心孔入手，运用锚定R18和K25氨基酸法，通过分子对接和虚拟筛选共挑选出了16个小分子，经SPR、单轮感染及细胞水平活性测试，发现了一个具有一定六聚体亲和力的结构全新的苗头化合物ZA-15,并通过结构优化得到抗病毒活性提升的ZA-30,该探索性研究为后续进一步发现全新位点抗HIV-1抗耐药性药物奠定了基础。