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摘要目的：<br>　　利用CUL4B基因突变患者来源的iPSCs,通过CRISPR/Cas9技术对突变进行矫正得到同基因型对照。利用iPSCs来源的2D神经干/神经元模型和3D脑类器官模型，分析CUL4B基因突变在神经系统发育中的作用及分子机制。<br>　　方法与结果：<br>　　1.利用CRISPR/Cas9技术构建CUL4B基因突变矫正型iPSC细胞系<br>　　本实验室前期构建了两株携带不同CUL4B基因突变的iPSC细胞系(分别命名为P1 和 P2)。P1 细胞系携带 CUL4B c.1564C＞T 突变，P2 细胞系携带 CUL4B c.1007_1011del突变。为了排除不同个体遗传背景的影响，获得同基因型对照细胞系，我们首先利用CRISPR/Cas9技术对这两株iPSC细胞系的基因突变分别进行了突变矫正。针对突变位点分别设计合成guide RNA(gRNA)和同源重组模板。将同源重组模板和打靶质粒通过电转方式导入到相应的iPSCs,经流式细胞术分选得到GFP+细胞(即外源载体成功导入的细胞)并进行单细胞克隆培养，通过Sanger测序筛选获得突变矫正的iPSCs。对突变矫正的iPSCs进行脱靶检测发现并无脱靶现象。通过免疫荧光染色和qRT-PCR实验发现突变矫正的iPSCs高表达多能性标志物SOX2、OCT4和NANOG等。G-显带核型分析发现基因编辑后的iPSCs核型保持正常，且CUL4B的mRNA和蛋白表达水平恢复到正常对照水平。这些结果说明基因突变矫正成功，两个突变矫正的iPSC细胞系分别命名为 Correct-P1 和 Correct-P2。<br>　　2.利用iPSCs来源的2D神经细胞研究CUL4B基因突变对神经发育的影响<br>　　1)CUL4B突变不影响iPSCs分化为神经干细胞的能力。为了研究CUL4B基因突变对神经发育的影响，我们首先采用单层贴壁法(2D神经诱导)将正常人来源的iPSCs(N1，N2)、XLMR 患者来源的 iPSCs(P1,P2)及其同基因型对照 iPSCs(Correct-P1,Correct-P2)诱导分化为神经前体细胞(Neural progenitor cells，NPCs)。在诱导过程中，对照和CUL4B突变细胞系在第8天时均失去了多能性基因OCT4和NANOG的表达，第16天时，所有细胞系均形成了玫瑰花环样的NPCs,并且表达相似水平的NPCs特异性标志物。这些结果表明缺失CUL4B并不影响iPSCs向NPCs的分化。<br>　　2)CUL4B突变的NPCs提前退出细胞周期并过早分化神经元。利用Ki67标记增殖细胞，在诱导培养第16天，患者来源的NPCs与对照组NPCs的增殖速度并无显著差异。然而，在诱导培养第25天时，与对照组相比，患者来源的NPCs的Ki67阳性细胞的比例明显降低，与此同时，患者组神经元标记物DCX和TUJ1的表达水平明显增高。这些结果提示CUL4B可能参与调节NPCs从增殖到分化的过程。因此我们采用EdU标记NPCs,并在标记后的48 h进行Ki67或DCX染色，与对照组相比，患者来源的EdU+细胞中Ki67-EdU+细胞和DCX+EdU+细胞比例显著升高，表明缺乏CUL4B的NPCs较对照细胞更早地退出细胞周期开始了神经元分化。<br>　　3)CUL4B突变导致神经元亚型比例失调。在神经分化第35天，大多数细胞分化为TUJ1+神经元，对深层神经元标志物TBR1和CTIP2的免疫染色显示，与对照神经元相比，患者来源的神经元中深层皮质神经元的百分比显著增加，MAP2+成熟神经元的百分比也升高。同样，qRT-PCR分析显示患者组深层神经元标记基因TBR1、CTIP2和FOXP2的表达水平升高。在神经分化第60天，qRT-PCR和免疫荧光检测发现患者来源的神经元中SATB2+和CUX1+浅层神经元的比例显著低于对照神经元。这些结果表明，缺失CUL4B导致深层神经元和浅层神经元比例失衡。<br>　　3.利用3D脑类器官分析CUL4B突变对神经发育的影响<br>　　1)CUL4B突变脑类器官生长减缓、花环结构偏小。将患者及其同基因型对照iPSCs进一步诱导分化为脑类器官，在诱导前三周，我们发现CUL4B突变脑类器官与对照脑类器官在生长状况方面未表现出显著差异。然而，随着培养时间延长，CUL4B突变脑类器官生长速度逐渐减慢。到第30天，可以明显看到CUL4B突变脑类器官的体积明显小于其同基因型对照组。进一步分析发现，CUL4B突变脑类器官的脑室区(VZ区)SOX2+NPCs层的厚度也显著低于对照组。同时，Ki67+细胞数量也有所减少，但NPCs凋亡情况并无显著差异。对SOX2+花环结构的周长、面积等指标进行定量分析，结果显示患者脑类器官中花环结构尺寸减小。<br>　　2)CUL4B突变脑类器官神经分化早熟。脑类器官EdU标记实验结果显示，在CUL4B突变脑类器官中，细胞周期退出的细胞(EdU+Ki67-细胞)和EdU+DCX+神经元的比例均显著增加。对第60天脑类器官进行神经祖细胞标记物PAX6、中间祖细胞(IPC)标记物TBR2和深层皮质标记物CTIP2染色，结果显示CUL4B突变脑类器官中SVZ区域的TBR2+细胞比例减少，CP区域的CTIP2+细胞比例增加，VZ区域的PAX6+TBR2-细胞比例也略有减少。同时，CUL4B突变脑类器官中SATB2+的浅层皮质神经元比例显著减少。这些结果与2D情况下观察的结果一致，证实了缺失CUL4B导致NPCs更早退出细胞周期分化为神经元。<br>　　3)CUL4B突变的脑类器官神经元兴奋性升高。为了探究CUL4B缺失是否影响神经元的突触形成和电生理功能，我们利用免疫荧光染色检测了突触蛋白，发现患者来源的脑类器官中SYN1+突触蛋白密度增加。通过微电极阵列技术(MEA)记录了第45天和第60天的脑类器官的神经自发电活动，发现CUL4B突变脑类器官自发放电活动更高，平均放电频率、Spike数量、Burst数和Burst频率都明显增加。<br>　　4.CUL4B突变影响神经发育的分子机制研究<br>　　1)CUL4B突变NPCs的转录组变化。为了阐明CUL4B突变影响神经发育的分子机制，我们对Correct-P1和P1 NPCs进行了转录组测序。CUL4B突变导致NPCs中1696个基因的表达发生显著改变。GO分析显示，患者来源的NPCs中上调的基因富集于神经元分化和神经发生相关基因。KEGG分析显示患者来源的NPCs中下调的基因富集于PI3K-AKT信号通路和MAPK信号通路。<br>　　2)CUL4B突变导致过早的细胞周期退出和神经元分化是由降低的AKT和ERK活性介导的。通过Western blotting对2D NPCs和3D脑类器官的分析发现，CUL4B突变NPCs和脑类器官中AKT和ERK的磷酸化水平均显著降低，其通路下游分子也相应下调。提示CUL4B突变引起的表型可能是由于AKT和ERK的活性降低所介导的。为了验证这一推测，我们利用AKT和ERK的抑制剂处理对照脑类器官，发现抑制AKT和ERK的活性影响了对照脑类器官的细胞周期退出及神经发生，呈现出与CUL4B突变脑类器官相似表型。相反，用AKT和ERK通路的激动剂处理患者来源的脑类器官则可以拯救细胞周期过早退出和神经元分化早熟的表型。这些结果证实CUL4B突变导致的过早的细胞周期退出和神经元分化是由降低的AKT和ERK活性介导的。<br>　　3)CUL4B通过抑制PPP2R2B和PPP2R2C转录来调节AKT和ERK的活性。在转录组测序结果中，我们观察到上调基因中包含编码PP2A复合物调节亚单位的PPP2R2B和PPP2R2C基因。PP2A可以去磷酸化AKT和ERK，提示CUL4B突变样本中观察到的AKT和ERK活性降低可能是由于PP2A的表达/活性增加造成的。为此，我们检测了CUL4B突变脑类器官和NPCs中PPP2R2B和PPP2R2C的表达水平及PP2A酶活性。结果显示患者NPCs和脑类器官中PPP2R2B和PPP2R2C的表达水平显著增加，PP2A酶活性也显著高于对照。用PP2A特异性抑制剂LB-100处理CUL4B突变脑类器官可以恢复AKT和ERK的磷酸化水平，并可以拯救由CUL4B突变引起的细胞周期提前退出和神经元分化早熟的现象。这些结果说明CUL4B通过抑制PPP2R2B和PPP2R2C转录来调节AKT和ERK的活性，进而影响神经发生。<br>　　4)CUL4B复合物直接结合在PPP2R2B和PPP2R2C基因启动子区域并抑制PPP2R2B、PPP2R2C的转录。CUL4B复合物可以通过对组蛋白H2AK119进行单泛素化，协同PRC2复合物发挥转录抑制作用。<br>　　结论：<br>　　1.CUL4B丧失功能突变导致NPCs细胞周期提前退出，神经分化早熟，神经元亚型比例失调。<br>　　2.CUL4B丧失功能突变导致脑类器官生长缓慢，神经发育早熟和神经元兴奋性高。<br>　　3.CUL4B丧失功能突变导致的过早神经元分化是由AKT和ERK活性抑制引起。<br>　　4.CUL4B通过抑制PPP2R2B和PPP2R2C基因转录来影响PP2A酶活，进而调节AKT和ERK的活性。