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摘要目的:基于亲和超滤-液质联用技术(AUF-LC-MS)快速靶向辨识甘草、连翘和金银花中抑制严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶(3CLpro)与木瓜蛋白酶样蛋白酶(papain-likeprotease,PLpro)的潜在活性成分，为从中药中发现抗SARS-CoV-2的新药提供研究基础。<br>　　方法:(1)3CLpro和PLpro的表达纯化与抑制剂筛选体系的稳定性验证:制备高纯度表达的3CLpro和PLpro,作为亲和超滤的靶蛋白。采用课题组前期构建的含有His标签的3CLpro和PLro原核表达质粒，经诱导表达并镍柱纯化获得原核表达的3CLpro和PLpro。同时采用Z-score评估基于荧光共振能量转移原理的3CLpro和PLpro药物筛选体系的稳定性。<br>　　(2)甘草、连翘和金银花甲醇提取物的化学成分表征:采用TCMSP等在线数据库，结合PubChem和CNKI等文献检索工具，建立甘草、连翘和金银花化学成分数据库(包括化合物名称、分子式、相对分子质量和裂解碎片等信息)。采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技术对甘草、连翘和金银花甲醇提取物的化学成分进行分析鉴定。<br>　　(3)基于AUF-LC-MS对甘草、连翘和金银花中抑制3CLpro和PLpro的潜在活性成分快速辨识:选择对靶蛋白具有较强抑制活性的化合物构建模式溶液，对亲和超滤中的孵育参数进行优化。采用优化后的AUF-LC-MS快速辨识甘草、连翘和金银花甲醇提取物中抑制3CLpro和PLpro的潜在活性成分，并进行酶活性评价。<br>　　(4)活性成分对3CLpro的酶抑制作用类型及体外抑制冠状病毒229E活性评价:选择对 3CLpro 半数抑制率浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)小于 50μM的化合物(ZY1、ZY2、ZY3),采用酶活性实验探讨ZY1、ZY2和ZY3对3CLpro相互作用的动力学模式。以HCoV-229E感染Huh-7细胞，采用CCK8法评价活性成分抗HCoV-229E的活性。<br>　　结果:(1)3CLpro和PLpro的表达纯化与抑制剂筛选体系的稳定性验证:构建了含有His标签的3CLpro和PLpro原核表达质粒，诱导表达后镍柱纯化制备高纯度原核表达的3CLpro和PLpro,SDS-PAGE结果显示其纯度大于90％,可作为亲和超滤的靶蛋白。3CLpro和PLpro的Z-score评分均大于0.5,表明高通量筛选体系稳定性好，重现性高，可以用于后续3CLpro和PLpro抑制剂的活性评价。<br>　　(2)甘草、连翘和金银花甲醇提取物的化学成分表征:采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技术根据质谱碎片、保留时间、中性丢失和参考文献等信息对甘草、连翘和金银花甲醇提取物进行定性分析，从甘草中共鉴定出74个化学成分，从连翘中共鉴定出26个化学成分，从金银花中共鉴定出41个化学成分。其中，甘草中包含64个黄酮类化合物、8个三萜类化合物和2个香豆素类化合物。连翘中为9个酚酸类化合物，7个黄酮类化合物，6个木脂素类化合物，3个苯乙醇苷类化合物和1个五环三萜类化合物。金银花共包含21个酚酸类化合物，14个黄酮类化合物和6个环烯醚萜类化合物。<br>　　(3)基于AUF-LC-MS对甘草、连翘和金银花中抑制3CLpro和PLpro的潜在活性成分快速辨识:3CLpro的亲和超滤条件优化结果为在样品与靶蛋白30℃下，用pH=6的Tris-HCl孵育20 min。在优化条件下，结合液质联用技术从甘草、连翘和金银花中共找到15个潜在的3CLpro抑制剂。其中，从甘草中发现4个潜在抑制剂，分别为甘草素(IC50=271.606.32μM)、异甘草素(IC50=165.40±4.50 μM)、ZY1(IC50=37.62±1.13μM)、ZY2(IC50=43.94±10.21 μM)。从连翘中发现 3 个潜在抑制剂，分别为芦丁(IC50=233.37±0.76μM)、ZY3(IC50=10.07±0.41 μM)和连翘苷(IC50＞361.52 μM)。从金银花中发现8个潜在抑制剂，分别为新绿原酸(IC50=161.40±3.25μM)、绿原酸(IC50=210.65±3.04 μM)、獐牙菜苦苷(IC50＞834.80μM)、隐绿原酸(IC50=135.40±12.02μM)、咖啡酸甲酯(IC50=50.70±6.63μM)、异绿原酸 B(IC50=117.6±7.35μM)、异绿原酸A(IC50=91.77±2.27μM)、异绿原酸C(IC50=116.00±3.39 μM)。在15个潜在抑制剂中，獐牙菜苦苷和连翘苷在最高给药浓度时对3CLpro的抑制率小于50％，来自甘草的ZY1和ZY2,以及来自连翘的ZY3对3CLpro的IC50小于50 μM。<br>　　PLpro的亲和超滤优化结果为化合物和靶蛋白30℃下，用pH=6的20 mM Tris-HCl孵育10min。在优化的条件下，结合液质联用技术从甘草、连翘和金银花中共找到了 11个潜在的PLpro抑制剂。它们分别为异甘草苷(IC50＞421.85 μM)、山奈酚(IC50=152.03±4.35μM)、毛蕊异黄酮(IC50＞1023.698 μM)、甘草查尔酮 A(IC50=102.90±0.20 μM)、异连翘酯苷 A(IC50＞384.25 μM)、芦丁(IC50=174.1±5.94μM)、连翘酯苷 A(IC50=326.00±6.44 μM)、绿原酸(IC50=397.43±19.21 μM)、木犀草苷(IC50=180.13±6.05μM)、异绿原酸 B(IC50=388.00±6.20 μM)和异绿原酸C(IC50=271.00±23.58μM)。其中，异甘草苷、毛蕊异黄酮和异连翘酯苷A在最高给药浓度时对PLpro抑制率小于50％,其余8个化合物对PLpro具有中等强度的抑制作用。<br>　　(4)活性成分对3CLpro的酶抑制作用类型及体外抗冠状病毒229E活性评价:选择甘草、连翘和金银花中对靶蛋白的IC50小于50μM的3个活性成分(ZY1、ZY2和ZY3)深入研究。酶活性结果表明，3个活性成分属于可逆混合型3CLpro抑制剂。细胞结果显示，ZY3对人肝癌细胞Huh-7的半数毒性浓度＞77.651μM，表明其细胞毒性较低，给药安全性较高。CCK8结果显示，ZY1和ZY2对冠状病毒HCoV-229E的半数效应浓度(EC50)为微摩尔级别，ZY3的EC50在10微摩尔级别。<br>　　结论:本论文以SARS-CoV-2复制过程中的关键蛋白3CLpro和PIpro为靶标，采用AUF-LC-MS从甘草、连翘和金银花中快速辨识了 13个对3CLpro具有一定抑制活性的化合物，发现8个对PLpro具有一定抑制活性的化合物。在以上化合物中，3个化合物(ZY1、ZY2和ZY3)对3CLpro的IC5o小于50 μM。在细胞水平抗冠状病毒HCoV-229E的活性结果表明ZY1、ZY2和ZY3具有开发为抗新冠药物的潜力。<br>　　本论文采用AUF-LC-MS从甘草、连翘和金银花中快速辨析对3CLpro和PLpro具有抑制作用的活性成分，为阐释中药抗SARS-CoV-2药效物质奠定基础，也为从中药中发现抗SARS-CoV-2的新药奠定基础。