摘要目的:以丹参多糖为指标,分别通过苯酚-硫酸法和单糖加和法计算丹参多糖含量,建立基于红外光谱(IR,官能团)、高效凝胶渗透色谱(HPGPC,分子量大小及分布)、高效液相色谱(HPLC,单糖组成)、气相色谱(GC,单糖组成)等信息在内的多重指纹图谱,对丹参的质量情况进行评价。并通过构建斑马鱼心脏损伤模型,研究丹参多糖在心脏保护方面的作用,从多糖角度阐明丹参的药效物质基础。<br> 方法:1.通过研究不同料液比、是否浓缩醇沉、脱脂后药渣是否干燥等因素,采用苯酚-硫酸法测定不同考察因素的多糖提取率并进行对比分析,确定丹参多糖的提取条件。分别通过苯酚-硫酸法、GC和HPLC单糖加和法测定60批次丹参多糖含量,确定丹参多糖的含量范围,从多糖含量层面对丹参多糖作出规定。<br> 2.建立基于IR、HPGPC、HPLC、GC在内的丹参多糖多重指纹图谱并构建对照特征图谱,进行相似度分析并借助化学计量学分析对多糖样品应有的官能团、分子量分布及单糖组成情况进行评价,进一步从多糖结构层面制定丹参药材的质量控制方法。<br> 3.以Tg(CmLc2:EGFP)斑马鱼为研究对象,采用立体荧光显微镜录像15 s计算心率,测定静脉窦-动脉球(SV-BA)间距和房室比,研究丹参多糖对斑马鱼的心脏保护作用。<br> 结果:1.确定了丹参多糖的最佳提取条件:脱脂和水提料液比1∶200,不浓缩,不醇沉,脱脂后不对药材进行干燥。通过苯酚-硫酸法测得丹参多糖含量范围为1.88-4.06%,平均含量为2.59%;GC单糖加和法得到的丹参多糖含量范围为1.10-2.01%,平均含量为1.55%;HPLC各单糖含量加和后含量区间范围为1.68-2.72%,平均含量为 2.27%。<br> 2.建立了基于IR、HPGPC、HPLC、GC在内的丹参多糖多重指纹图谱并构建对照特征图谱,其中红外特征图谱有9个特征峰。丹参多糖分子量分布根据峰的起伏、位置及保留时间分为了 3个部分。丹参多糖单糖组成指纹图谱结合化学计量学分析得到的特征图谱显示,GC特征图谱标定有5个单糖特征峰,将肌醇六乙酸酯的峰定为S峰,计算各色谱峰与S峰的相对保留时间为0.36(鼠李糖)、0.39(阿拉伯糖)、0.73(甘露糖)、0.76(葡萄糖)、0.80(半乳糖)、1.00(肌醇六乙酸酯);HPLC特征图谱标定有8个单糖特征峰,将半乳糖醛酸的峰定为S峰,计算各单糖峰与S峰的相对保留时间为0.56(甘露糖)、0.73(核糖)、0.77(鼠李糖)、0.89(葡萄糖醛酸)、1.00(半乳糖醛酸)、1.18(葡萄糖)、1.34(半乳糖)、1.47(阿拉伯糖)。各特征峰与S峰的相对保留时间在规定值的±10%之内。<br> 3.初步建立了基于多糖的丹参质量标准草案,包含了丹参多糖含量测定的2种方法——苯酚硫酸法、单糖加和法,以及提供了基于丹参多糖单糖组成的GC和HPLC特征图谱,为丹参质量标准提升提供了依据。<br> 4.丹参多糖可以使斑马鱼心脏损伤模型心包水肿、血细胞堆积、血流速度缓慢等况有明显改善,且心率显著恢复,心律不齐的现象也减轻,表明心脏损伤得到了修复。丹参多糖低、中、高剂量可以减少心脏损伤斑马鱼的SV-BA间距,说明具有心脏损伤修复的效果。房室比研究结果显示丹参多糖对斑马鱼房室比异常现象有一定的修复作用。<br> 结论:本研究通过苯酚-硫酸法和单糖加和法规定了丹参多糖含量范围,建立了基于官能团(IR)、分子量(HPGPC)、单糖组成(HPLC、GC)等在内的多重指纹图谱,并建立了可用于评价丹参质量的特征图谱,构建了丹参多糖的质量标准草案,从多糖层面实现了丹参的质量控制。通过Tg(CmLc2:EGFP)斑马鱼心脏损伤实验,表明丹参多糖可通过修复斑马鱼心脏损伤和房室比异常表现出心脏保护活性。
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