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摘要目的:<br>　　制备一种能键合多种中药炒莱菔子成分的探针，通过成分与靶点间的亲和作用，从大鼠肠道组织中垂钓出与炒莱菔子成分特异性结合的靶蛋白，通过GO富集与KEGG分析得到与“消食除胀”密切相关的靶点与通路，并通过动物实验进行验证，以期在中药整体性理论的基础上对炒莱菔子消食除胀的作用机制进行阐明，为其临床现代化应用提供科学依据。<br>　　方法:<br>　　1.Fe3O4磁性纳米粒子的制备与表征:采用溶剂热法合成羧基化的Fe3O4磁性纳米粒子(Fe3O4-COOHMNPs)载体，并通过纳米粒度电位仪，红外光谱，扫描电镜，透射电镜对粒子的粒径、形貌、官能团以及元素组成进行表征。<br>　　2.Fe3O4磁性纳米粒子的衍生化:通过置换反应与接枝聚合反应逐级制备出巯基化的Fe3O4磁性纳米粒子(Fe3O4-SH MNPs)与键合二苯甲酮基团的Fe3O4磁性纳米粒子(Fe3O4-BP MNPs)载体，并通过扫描电镜、透射电镜、红外光谱等对衍生化后的粒子的粒径、形貌、官能团、元素组成进行表征。同时，以AC-S/AFe-O为指标，通过红外半定量的方法对巯基化反应中的反应时间与反应物比例进行了优化筛选。<br>　　3.键合炒莱菔子成分的光交联探针的制备与键合成分的分析:通过光交联反应，将炒莱菔子提取液中的成分键合到Fe3O4-BP MNPs载体表面，构建包含炒莱菔子多种成分的探针，并使用透射电镜对探针的形貌进行了表征。同时，通过HPLC分析了炒莱菔子反应前、后溶液中的成分变化，并采用UPLC-Q-Exactive OrbitrapMS/MS对反应后水解液中的成分进行了进一步鉴定。<br>　　4.炒莱菔子成分靶标蛋白的“垂钓”与鉴定分析:取大鼠肠道组织，加入裂解液提取大鼠肠道组织总蛋白，与键合了炒莱菔子成分的探针共孵育，通过成分与蛋白间的特异性结合，选择性的垂钓出能与炒莱菔子成分结合的蛋白。采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS/MS和pFind软件对靶标蛋白进行鉴定，并通过David数据库对筛选出的靶点进行分析，从分析结果中筛选得到可能与炒莱菔子消食除胀作用相关的通路，并选择部分密切相关通路进行后续实验验证。<br>　　5.炒莱菔子成分促进平滑肌收缩的机制验证研究:根据上述结果设计分组给药,分别给予大鼠炒莱菔子提取液与萝卜苷(GRE)进行干预，连续给药7天后，采用蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)实验法，测定大鼠肠道组织中肌球蛋白轻链(MLC)的蛋白表达水平。<br>　　结果:<br>　　1.Fe3O4-COOHMNPs的表征结果:红外光谱显示有明显的574 cm-1左右的Fe-O伸缩振动峰，1632 cm-1左右的C=O伸缩振动峰以及3385 cm-1左右的O-H伸缩振动峰，提示通过溶剂热法成功合成了 Fe3O4-COOHMNPs。纳米粒度电位仪测量结果表明粒子在水溶液中的存在状态均匀，粒径在100 nm左右。透射电镜与扫描电镜的结果显示，单个粒子为不规则球形，粒径在5-10 nm左右，粒子在水溶液中常以聚集体的形式存在，聚集体粒径在60 nm左右。扫描电镜能谱测定结果中C元素的存在也证实了 Fe3O4-COOH MNPs的成功合成。<br>　　2.Fe3O4-SH MNPs 与 Fe3O4-BP MNPs 的表征结果:Fe3O4-SH MNPs 的扫描电镜与透射电镜的结果表明，粒子表面有絮状物，体积较Fe3O4-COOHMNPs略有增加。扫描电镜的能谱测定结果显示粒子表面有S元素存在，结合红外谱图中950 cm-1左右的C-S伸缩振动峰，可以证明Fe3O4-SH MNPs制备成功。红外半定量结果表明，随着反应时间的增加以及二巯基丁二酸(DMSA)用量的增加，AC-S/AFe-O的值逐渐增加，表明粒子表面的巯基增多，巯基化反应越完全。Fe3O4-BP MNPs的红外表征显示有苯环的骨架振动峰以及二苯甲酮的C=O的伸缩振动峰，证实了 Fe3O4-BP MNPs的合成。<br>　　3.键合炒莱菔子成分的探针的表征与键合前、后成分的分析:炒莱菔子反应前溶液与反应后上清液中各成分的HPLC谱图对比结果表明，多数成分，如GRE、芥子碱、芥子酸等成分的峰面积皆有所下降。UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS/MS分析显示在反应后水解液中鉴定出12种化合物，其中大多数化合物属于小分子有机酸类，炒莱菔子中其他类化合物如硫苷类、生物碱类以及寡糖酯类化合物未被鉴定出。对比炒莱菔子的碱水解液HPLC谱图，推测上述化合物未被鉴定出的原因可能是在碱水解过程中被破坏。总而言之，上述结果说明，利用光交联反应将炒莱菔子中的多种成分固定在含有二苯甲酮基团的磁性纳米粒子上是可行的。<br>　　4.炒莱菔子成分的靶标蛋白“垂钓”与鉴定分析:利用成分与蛋白间的特异性结合，从大鼠肠道组织裂解液中垂钓并成功鉴定出了 63个蛋白。GO富集的结果表明，所垂钓出的蛋白主要集中在细胞质、线粒体、细胞骨架、膜阀等部位，可能通过影响蛋白结合、调节脂肪酶活性、调控ATP的合成起到消食除胀的作用。KEGG分析结果显示，蛋白主要集中在胰腺分泌、糖酵解/糖异生、内质网中的蛋白质加工、丙酮酸代谢、蛋白质消化和吸收、碳代谢、cGMP-PKG、HIF-1等信号通路。上述结果表明炒莱菔子可能通过促进胰液分泌、调节平滑肌运动、调控能量代谢、促进蛋白质与脂质的消化，起到消食除胀的作用。此外，KEGG结果还表明，通过炒莱菔子成分垂钓的靶蛋白MLCP是cGMP-PKG信号通路下游的重要蛋白，可通过调控其下游蛋白MLC的磷酸化水平影响胃肠道平滑肌的收缩，在调控胃肠平滑肌运动中占据重要地位。因此，通过促进MLC蛋白的磷酸化进而促使胃肠平滑肌收缩可能是炒莱菔子消食除胀的重要机制。<br>　　5.炒莱菔子促平滑肌运动的机制研究:蛋白质免疫印迹（Western blot，WB）实验结果表明，炒莱菔子提取液与GRE都可通过增加大鼠肠组织中MLC蛋白的磷酸化，促进肠道平滑肌收缩，发挥消食除胀的作用。<br>　　结论:<br>　　本实验成功构建了键合多种炒莱菔子成分的光交联探针，并通过该探针从大鼠肠道组织中垂钓出63个靶蛋白。生物信息学分析初步阐释了炒莱菔子发挥消食除胀作用的机制可能与促进胰液分泌、催化ATP的合成、调节平滑肌运动、促进蛋白质与脂质的消化等有关。最后，通过WB实验验证了促进MLC蛋白的磷酸化进而促使胃肠平滑肌收缩是炒莱菔子消食除胀的作用机制之一。