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摘要目的:本研究基于荧光探针与β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)竞争性结合的思路，设计并合成了一种新型近红外荧光探针;以荧光探针为导向，对58种中药β-gal抑制活性进行了高通量筛选，并对中药紫草复杂成分的靶向分离和鉴定，筛选出β-半乳糖苷酶抑制剂(β-galactosidaseinhibitor,β-galI)β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁;分别在动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)细胞、斑马鱼和小鼠模型上进行活性成分药效学评价。<br>　　方法:1.设计合成一种特异性检测β-gal的近红外荧光探针，利用荧光光谱仪，对探针的光谱学性质进行表征并对其筛选β-galI能力进行评价;通过激光共聚焦显微镜与小动物活体成像仪，考察生理状态下探针在细胞、斑马鱼和小鼠主动脉血管组织中检测β-gal的能力。<br>　　2.选取58种中药提取物作为筛选对象，其中紫草乙醇提物对β-gal具有较强的抑制活性，进一步采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(Ultra-highPerformanceLiquidChromatography-Quadrupole-Orbitrap-high-resolutionMassSpectrometer,UPLC-Q-Orbitrap-MS)技术结合荧光探针对紫草中的化学成分进行靶向分离并评价单体化合物的β-gal抑制活性。<br>　　3.选取RAW264.7细胞，建立不同刺激诱导的细胞模型，利用荧光探针评价β-gal活性变化。在所得研究结果的基础上，开展β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁在模型细胞上抑制β-gal的药效学实验。<br>　　4.选取3dpf野生型斑马鱼给与脂多糖(LPS)持续诱导建立AS斑马鱼模型，利用荧光探针评价β-gal含量变化。在所得研究结果的基础上，开展β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁在AS斑马鱼模型上抑制β-gal的药效学实验。<br>　　5.七周龄雄性ApoE-/-小鼠给与高脂饲料持续饲养诱导的AS小鼠模型，造模12周后，将模型组小鼠随机分为模型组，阳性药达沙替尼+槲皮素组，β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁高剂量组、中剂量、低剂量组，同周龄雄性C57BL/6小鼠作为空白对照组。利用小动物成像仪测定不同组别之间小鼠主动脉血管组织β-gal活性差异。<br>　　结果:1.探针NFP-β-gal以丙二腈衍生物为基本骨架，通过引入半乳糖基作为识别基团，实现对β-gal的快速检测。探针具有较快的响应速度、良好的选择性、较高的灵敏度，并且激光共聚焦成像实验表明该探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体副作用较小，其发射光谱在近红外区，可以有效规避中药化学成分中的荧光干扰，提高检测的灵敏度，且操作简单方便，合成成本低，在中药β-galIs筛选方面具有良好的应用前景。<br>　　2.基于近红外荧光探针对58种中药对β-gal的抑制活性进行评价，其中紫草对β-gal显示出较强的抑制活性。中药紫草总提取物经过不同极性溶剂萃取之后，荧光探针对其进行活性检测，选取β-gal抑制活性最好的石油醚部位，进行质谱解析，共鉴定出38种化学成分;利用硅胶柱色谱对石油醚部位分离，共得到6个不同极性组分，荧光探针活性检测得到活性抑制最好组分，对组分内的化合物结构解析，共得到5个紫草素类成分。分别对活性单体进行荧光检测，最终筛选出活性成分β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁。分子对接实验表明β-gal与β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁有较强结合能力。<br>　　3.CCK8实验表明，探针NFP-β-gal和β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁对细胞生物毒性较小，具有良好的生物相容性;在荧光探针辅助下，细胞实验结果显示，H2O2与氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）可成功建立细胞模型，β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁干预治疗之后，与模型组相比荧光强度显著降低，这说明β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁在生理状态下，具有良好的β-gal抑制活性。<br>　　4.构建斑马鱼动脉粥样硬化模型，β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁干预治疗之后，与模型组相比荧光强度显著降低，这说明β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁能够有效抑制β-gal活性，在延缓AS进程方面拥有良好潜力。<br>　　5.小鼠主动脉组织中β-gal含量荧光成像结果显示，β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁药物治疗之后，与模型组相比，荧光强度信号明显降低，说明β-gal活性得到抑制，高剂量β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁治疗组的β-gal含量相较于模型组也具有统计学意义，这表明β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁具有抑制β-gal活性，延缓AS病情发展的良好潜力。<br>　　6.小鼠脑主动脉弓油红O染色和HE染色结果显示，与正常组相比，模型组主动脉斑块面积明显增多，经过β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁治疗之后，主动脉斑块面积显著降低，脂肪堆积减少。结果表明，给药之后主动脉组织的病理变化得到了明显改善。<br>　　结论:1.设计合成了一种新型近红外β-gal荧光探针，建立了中药活性成分筛选平台，并结合LC-MS技术对中药紫草中的复杂成分进行靶向分离和鉴定，筛选出活性成分β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁;<br>　　2.在AS细胞、斑马鱼和小鼠模型上进行化合物药效评价，β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁能够有效抑制β-gal活性，是潜在的天然抑制剂，有望进行下一步的开发与利用。