检索历史 清除

摘要研究目的：<br>　　Ⅰ型遗传性酪氨酸血症(Hereditary Tyrosinemia type 1，HT1)是一种因延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fumarylacetoacetate hydrolase，FAH)缺陷而引起的酪氨酸代谢异常、严重肝肾损伤的罕见常染色体隐性遗传代谢疾病。其中，肝脏是HT1患者受累最为严重的器官，但目前临床上对HT1的治疗方法仍非常有限。近年来，随着合成生物学技术的快速发展，通过构建工程益生菌，重塑宿主代谢，为治疗遗传代谢罕见病提供了新型干预手段。<br>　　本文旨在以益生菌E.coli Nissle 1917(EcN)为底盘微生物构建一株高效代谢酪氨酸的工程益生菌EcN-HT，进而探讨其对酪氨酸的降解能力及对HT1诱导的致死性肝损伤的保护作用，为临床治疗HT1提供新的治疗思路。<br>　　研究方法：<br>　　1.用于降解酪氨酸的工程菌株的构建及验证<br>　　(1)利用CRISPR-Cas9技术将目的基因插入EcN基因组，构建酪氨酸代谢重编程工程益生菌。<br>　　(2)验证工程益生菌体外及体内降解酪氨酸的能力。<br>　　(3)评估工程益生菌EcN-HT的生长增殖活力及体内代谢动力学检测。<br>　　(4)细菌RAN-seq检测EcN-HT的基因表达变化。<br>　　2.EcN-HT挽救Fah-KO小鼠致死性肝损伤的有效性研究<br>　　(1)评估EcN-HT治疗Fah-KO小鼠急性肝损伤的有效性。<br>　　(2)通过中期(4周)和长期(10周)实验，探索EcN-HT是否可以挽救Fah-KO小鼠的慢性致死性肝损伤。<br>　　3.工程益生菌EcN-HT的治疗安全性评估<br>　　(1)探索EcN-HT对小鼠肠道微生物群多样性的影响。<br>　　(2)验证EcN-HT对小鼠是否具有致病性。<br>　　(3)验证EcN-HT灌胃后是否向肠外组织播散或个体间传播。<br>　　研究结果：<br>　　本研究成功构建一株高效分解酪氨酸的工程益生菌株EcN-HT。我们发现，目的基因片段HpaBC、TyrP的插入诱导了 EcN-HT的全局重编程。急性及慢性动物模型实验表明，EcN-HT有效挽救Fah-KO小鼠致死性肝损伤，改善了小鼠肝脏酪氨酸代谢及稳态相关基因的表达。最后，我们发现口服EcN-HT对小鼠肠道菌群组成及肠外组织没有致病作用，此外EcN-HT不会导致健康个体酪氨酸缺乏，具有一定的治疗安全性。<br>　　研究结论：<br>　　我们的数据表明，EcN-HT可有效挽救Fah-KO小鼠的致死性肝损伤，且EcN-HT经口给药方式无明显毒副作用，这为临床治疗HT1提供了新的思路。