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摘要免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint inhibitors，ICIs)改变了肺癌的治疗模式，延长了患者生存时间，肿瘤三级淋巴结构(Tertiary lymphoid structure,TLS)作为影响非小细胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma,NSCLC)患者预后及免疫治疗疗效的关键因素，其形成机制有待阐明。对比表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR）野生型肺腺癌(Lung adenocarcinoma,LUAD),EGFR突变型LUAD肿瘤微环境为免疫抑制型，TLS在EGFR突变型及野生型LUAD中的浸润模式及免疫功能差异需要进一步探索。<br>　　目的<br>　　评估TLS对LUAD预后的影响并探索不同成熟状态TLS的分子特征及其对肿瘤免疫微环境的影响，构建TLS相关基因风险评分模型预测NSCLC免疫治疗疗效;分析EGFR突变型和野生型LUAD肿瘤免疫微环境及TLS空间分子特征，以及TLS在不同分子亚型LUAD中发挥的免疫功能并寻找潜在治疗靶点。<br>　　方法<br>　　1、利用CDSA平台来源的病理切片，对TCGA-LUAD患者进行TLS分类，评估不同成熟状态TLS对临床结局的影响。RNA-Count数据用来分析差异表达的基因。从GEO数据库下载免疫治疗数据集GSE111414和GSE136961。基于GSVA和GO、KEGG分析探索信号通路的变化。利用ssGSEA和xCell算法分析免疫细胞浸润特征。采用WGCNA,Lasso及多因素Cox回归分析构建基因风险评分模型。<br>　　2、前瞻性收集经手术切除的肺癌患者标本，H&E染色后判断TLS浸润情况，符合条件的LUAD肿瘤标本制备组织芯片，染色后圈选感兴趣区域，包括TLS阳性肿瘤的TLS区(TLS区)和肿瘤浸润淋巴细胞区(Tumor infiltration lymphocytes,TILs)(TLS+/TILs区)，以及TLS阴性肿瘤的TILs区(TLS_N区)的勾画，随后采用数字空间组学技术进行全转录组测序并分析。<br>　　结果<br>　　第一部分:<br>　　1、多因素Cox回归分析表明，TLS是总生存时间(Overall survival,OS)的独立预后因素(p=0.029)。与TLS阴性和TLS未成熟组相比，TLS阳性和TLS成熟组均上调免疫激活相关通路。TLS成熟比TLS未成熟组肿瘤免疫微环境中有更多的激活树突状细胞和记忆B细胞浸润。<br>　　2、我们构建了基于TLS相关基因的风险评分模型。生存分析表明，低风险组中位无进展生存时间(Progression free survival，PFS)优于高风险组(p＜0.001),将基因风险评分与患者年龄，吸烟状态和PD-L1表达情况结合进行免疫治疗PFS预测，校准曲线及ROC曲线结果表明该组合模型的预测效能优于单个临床指标。<br>　　第二部分:<br>　　1、对比EGFR野生型肿瘤，EGFR突变型肿瘤细胞高表达免疫抑制分子;EGFR突变型与野生型肿瘤TLS区分子特征有较大的同质性;免疫检查点分子HLA-G和PVRIG在EGFR突变型肿瘤TLS区表达上调;与EGFR野生型肿瘤TLS_N区对比，EGFR突变型肿瘤TLS_N区上皮侵袭及转移能力更强。<br>　　2、在EGFR突变型肿瘤中，TLS可以形成局部激活的免疫微环境，T细胞的分子特征有明显的空间异质性，对比TLS+/TILs区，FCRLA,CXCL13,MSA4A1,CD19,SELL等标记物在TLS区T细胞中表达上调，部分与免疫治疗疗效显著相关;而TLS+/TILs区免疫球蛋白相关基因IGHA1及浆细胞相关基因MZB1上调，伴浆细胞浸润增多;免疫检查点分子SIGLEC10,BTLA,PVRIG和HMGB1在TLS区、TLS+/TILs区和TLS_N三组间的表达呈逐渐下降趋势。<br>　　3、在EGFR野生型肿瘤中，对比TLS阴性，TLS阳性肿瘤微环境中iTreg，Tfh及B细胞系浸润增多，TLS与TLS+/TILs区空间异质性较小;对比TLS阳性肿瘤的TLS+/TILs区,TLS阴性肿瘤上皮细胞增殖活跃，肿瘤侵袭能力增强。免疫检查点分子CEACAM1在TLS阴性EGFR突变型及野生型肿瘤中均上调。<br>　　结论<br>　　1、TLS与更好的临床结局显著相关，伴有成熟TLS形成的肿瘤能够发挥更好的抗肿瘤免疫反应;利用TLS相关基因构建的预测模型可以预测NSCLC的免疫治疗疗效。<br>　　2、与EGFR野生型相比，EGFR突变型LUAD肿瘤上皮免疫抑制分子表达上调，但在EGFR突变型肿瘤中，TLS可以形成局部激活的免疫微环境,T细胞分子特征具有明显的空间异质性;靶向EGFR突变肿瘤TLS中上调的免疫检查点分子可能成为潜在的治疗策略。