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摘要目的:基于“治未病”理论，观察龟鹿二仙胶合五子衍宗丸(以下简称“二五合方”)治疗卵巢储备功能减退(diminished ovarian reserve,DOR)的临床疗效，并聚焦于内质网应激-凋亡信号通路，进一步探讨二五合方治疗DOR的作用机制，以期为临床治疗DOR提供循证依据及治疗靶点。<br>　　方法:1.临床研究:选取就诊于山东第一医科大学附属省立医院中医科门诊符合纳排标准的70例DOR患者，并随机分为观察组和对照组(n=35)，观察组患者给予中药二五合方治疗，对照组患者行西药雌孕激素序贯治疗，均连续服用3个月经周期。比较两组患者治疗前后肾虚证量化积分、血清促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、雌二醇(estradiol,E2)、抗缪勒管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)水平及双侧基础窦卵泡数(antral follicle count,AFC)的变化。2.实验研究:(1)选择有规律动情周期的59只大鼠进行实验，并将其分为空白组(9只)及模型组(50只)，模型组大鼠每日给予雷公藤多苷片混悬液(50mg/kg)灌胃，空白组给予等体积生理盐水灌胃，连续14天。阴道涂片观察大鼠动情周期，证实模型组造模成功后，将其随机分为模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、西药组。参照人与大鼠之间药物剂量换算方法确定各组灌胃药物剂量，中药低剂量组为5.6175g/kg/d,中药中剂量组为11.235g/kg/d，中药高剂量组为22.47 g/kg/d，连续15天;西药组连续3天给予戊酸雌二醇片混悬液0.1mg/kg/d，第4天联用黄体酮胶囊混悬液21mg/kg/d,第5天停药一天，周而复始三个周期;空白组、模型组给予等体积生理盐水灌胃，共15天。给药结束后观察大鼠一般情况、体质量、卵巢湿重及动情周期等变化，计算卵巢指数，酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测血清FSH、E2及 AMH水平，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色镜下观察大鼠卵巢各级卵泡变化，透射电镜下观察大鼠卵巢的超微结构，主要包括颗粒细胞的形态结构及线粒体、内质网等细胞器变化。(2)通过免疫印迹法(Western Blot)及实时荧光定量PCR法(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)分别检测DOR大鼠卵巢组织中凋亡及自噬相关基因(Bax、Bcl-2、Beclin-1、P62)的蛋白及 mRNA 表达。(3)通过 Western-Blot 及 RT-qPCR分别检测DOR大鼠卵巢组织中内质网应激-凋亡信号通路相关基因（PERK、eIF2α、ATF4、CHOP）的蛋白及mRNA表达。<br>　　结果:1.临床研究:（1）肾虚证量化积分:两组患者治疗后，肾虚证量化积分水平较治疗前均明显降低（P＜0.001）,且观察组低于对照组（P＜0.01）。（2）血清激素水平:两组患者治疗前后的血清AMH（ng/ml）比较差异均无统计学意义（P＞0.05）;两组患者治疗后的血清FSH（mIU/ml）水平低于治疗前（P＜0.001），且对照组低于观察组（P＜0.05）;两组患者治疗后的血清E2（pg/ml）水平较治疗前降低（P＜0.001），两组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）超声指标:两组患者治疗后双侧AFC数均高于治疗前（P＜0.001），但两组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。2.实验研究:（1）体质量、卵巢湿重及卵巢指数:与空白组相比，模型组大鼠体质量、卵巢湿重明显减轻（P＜0.01或P＜0.001），卵巢指数显著下降（P＜0.001）;与模型组相比，各治疗组大鼠体质量、卵巢湿重及卵巢指数显著增加（P＜0.001或P＜0.01或P＜0.05），且各治疗组间比较无统计学差异（P＞0.05）。动情周期:空白组大鼠动情周期规律;与空白组相比，模型组大鼠动情周期紊乱率明显升高（P＜0.001）;与模型组相比，中药中高剂量组及西药组大鼠动情周期紊乱率明显降低（P＜0.05）。血清激素水平变化:与空白组相比，模型组大鼠血清FSH水平明显上调，AMH、E2水平明显下调（P＜0.001）;与模型组相比较，中药高剂量组及西药组血清AMH含量明显增加（P＜0.001），中药各剂量组及西药组E2显著升高（P＜0.05,P＜0.001），中药中、高剂量组及西药组血清FSH含量明显下降（P＜0.001或P＜0.01）。卵泡发育情况:空白组大鼠卵巢形态结构正常，可见各级生长卵泡和黄体，闭锁卵泡数量少;模型组大鼠卵巢各级卵泡及黄体数量明显减少，药物干预后均有不同程度增加，闭锁卵泡减少。超微结构:空白组镜下可见颗粒细胞的形态结构正常，细胞器结构较完整清晰;模型组可见颗粒细胞的形态结构异常，与闭锁卵泡一致，线粒体数量减少并伴肿胀，粗面内质网明显扩张，胞浆中可见少量自噬小体;各治疗组镜下可见颗粒细胞形态结构较正常，只有少部分线粒体轻度固缩，粗面内质网轻度扩张，特别是中药高剂量组胞浆中可见较多的自噬小体和（或）自噬溶酶体。（2）与空白组相比，模型组大鼠卵巢组织Bax、P62的蛋白及mRNA水平均显著上调（P＜0.001），Bcl-2及Beclin-1的蛋白及mRNA水平均显著下调（P＜0.001或P＜0.01或P＜0.05）;与模型组相比，中药中、高剂量组及西药组Bax、P62的蛋白及mRNA表达均有不同程度的降低（P＜0.001），Bcl-2及Beclin-1的蛋白及mRNA表达均有不同程度升高。（3）与空白组相比，模型组大鼠卵巢组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOP的蛋白及mRNA水平显著上调（P＜0.001）;与模型组相比，中药各剂量组及西药组的PERK、eIF2α、ATF4、CHOP蛋白及mRNA表达水平均有不同程度的下调（P＜0.001）<br>　　结论:1.临床研究:二五合方可明显改善DOR患者肾虚证候量化积分，改善月经症状、血清激素表达，以及提高基础卵泡数等相关指标;2.实验研究:（1）利用雷公藤多苷片混悬液可成功构建DOR大鼠模型，二五合方可降低其动情周期紊乱率、提高卵巢指数、调节激素水平、减少卵泡闭锁等;二五合方可改善DOR大鼠的卵巢超微结构，具体表现为修复颗粒细胞的形态结构，增加线粒体的数量，减轻线粒体肿胀及内质网扩张等;（2）DOR大鼠卵巢存在细胞凋亡及自噬不足现象，二五合方可抑制DOR大鼠颗粒细胞的凋亡，提高颗粒细胞自噬水平;（3）雷公藤多苷可通过激活PERK/eIF2α/ATF4/CHOP内质网应激信号通路，诱导细胞凋亡，二五合方可抑制该通路的过度激活，减轻内质网过度应激，减少细胞凋亡，进而改善卵巢功能。