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摘要第一部分:NISCH基因突变在先天性阴道发育不全中的致病性研究<br>　　研究背景<br>　　胚胎期苗勒管和/或泌尿生殖窦发育异常或停滞可以导致多种女性生殖道发育畸形，如先天性阴道闭锁和MRKH(Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser)综合征等。目前关于阴道发育不全的分子遗传机制仍知之甚少。高通量测序技术如全基因组测序等的飞速发展为生殖道畸形的致病机制研究提供了基础。NISCH是调控细胞骨架、细胞侵袭迁移等生物学过程的重要基因。已有文献报道提出Nisch基因突变可以导致小鼠发育受限、听力丧失等，但NISCH基因在女性生殖道发育中的作用及在先天性阴道闭锁和MRKH综合征中的致病机制尚不清楚。<br>　　研究目的<br>　　基于全国先天性阴道闭锁和MRKH综合征队列的全基因组和全外显子测序数据，通过体外和体内功能验证探索NISCH基因突变在先天性阴道发育不全中的致病性。<br>　　研究方法<br>　　对105例先天性阴道闭锁患者外周血DNA进行全基因组测序，通过突变负荷分析筛选到候选致病基因NISCH,同时在课题组前期已完成测序的MRKH综合征队列中筛选可能致病的NISCH基因突变位点。利用Sanger测序对所有突变位点的真实性进行验证。根据基因的生物学功能，开展体外实验对各突变位点的致病性进行验证。构建Nisch基因全身敲除小鼠，观察Nisch纯合敲除小鼠的生殖道表型。<br>　　研究结果<br>　　1.在105例先天性阴道闭锁患者队列中筛选出2个致病性突变位点，分别为c.1A＞G和c.4102del。在已完成测序的MRKH综合征队列中筛选出6个可能致病的错义突变位点，分别为:c.1456A＞G,c.2206A＞T,c.2474A＞T,c.2620G＞T,c.2851G＞A和 c.3551C＞A。<br>　　2.细胞水平实验研究发现c.2620G＞T位点突变使Nischarin蛋白表达下降。<br>　　3.细胞水平实验研究发现c.2206A＞T,c.2474A＞T和c.3551C＞A位点突变后Nischarin蛋白对整合素ITGA5的抑制作用减弱。<br>　　4.细胞水平实验发现c.2620G＞T,c.2851G＞A和c.3551C＞A位点突变后细胞内F-actin减少，而c.2206A＞T和c.2474A＞T位点突变使细胞内F-actin形态改变。<br>　　5.基因敲除小鼠模型提示Nisch-/-雌鼠出现生殖道发育异常，表现为子宫纤细、子宫固有层结构疏松、阴道鳞状上皮缺失。<br>　　研究结论<br>　　本研究在先天性阴道闭锁和MRKH综合征患者中发现NISCH基因突变。细胞实验和动物模型提示NISCH基因突变可以影响细胞骨架和细胞运动等功能，敲除Nisch基因可以影响小鼠生殖道发育。本研究结果提示NISCH基因是先天性阴道发育不全的可能致病基因。<br>　　第二部分:RBBP5基因突变在先天性阴道发育不全中的致病性研究<br>　　研究背景<br>　　苗勒管和/或泌尿生殖窦发育异常可以导致女性生殖道发育畸形，其中先天性阴道闭锁和MRKH(Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser)综合征是主要的阴道发育不全性疾病，发病机制仍不明确。RBBP5基因编码的RbBP5蛋白是组蛋白H3赖氨酸K4甲基转移酶复合物的重要组成分子，参与基因表达调控、胚胎发育和器官分化等生物学过程。该复合物中其他蛋白功能丧失已被证实可以导致胚胎死亡和多器官发育缺陷，但尚无文献报道RBBP5基因在胚胎发育，尤其是女性生殖道发育中的作用。<br>　　研究目的<br>　　基于全国先天性阴道闭锁和MRKH综合征队列的全基因组和全外显子测序数据，通过体外和体内功能验证探索RBBP5基因突变在先天性阴道发育不全发生中的致病性。<br>　　研究方法<br>　　对105例先天性阴道闭锁患者外周血DNA进行全基因组测序和遗传学分析，发现先天性阴道闭锁的新的候选致病基因RBBP5,同时在课题组前期已完成测序的MRKH综合征队列中筛选可能致病的RBBP5基因突变位点。验证所有突变位点的真实性。体外实验验证各突变位点的致病性。构建Rbbp5基因敲除小鼠观察生殖道表型。<br>　　研究结果<br>　　1.在105例先天性阴道闭锁患者中发现1个RBBP5基因致病性突变c.919C＞T,1个剪接位点突变c.906+5G＞C,另外在MRKH综合征队列中筛选出2个错义突变c.437C＞T 和 c.1324G＞A。<br>　　2.Minigene实验证实非经典剪接突变c.906+5G＞C产生2种变异剪接产物:8号外显子完全缺失和8号内含子完全滞留，异常的剪接产物导致RBBP5基因功能丧失。<br>　　3.细胞水平实验发现RBBP5错义突变c.1324G＞A导致RbBP5蛋白与甲基转移酶复合物中Ash2L-1蛋白的结合下降。<br>　　4.甲基化芯片测序结果发现RBBP5基因致病性突变患者DNA甲基化水平明显区别于RBBP5错义突变和无突变患者，GO富集分析发现差异甲基化位点主要富集在减数分裂、女性配子发生和排卵、神经元发育和信号转导等功能中。<br>　　5.动物模型发现Rbbp5纯合缺失可能导致小鼠在胚胎期死亡。<br>　　研究结论<br>　　本研究在先天性阴道闭锁和MRKH综合征患者中发现RBBP5基因突变。细胞实验提示RBBP5基因突变可以影响RbBP5蛋白的结合功能。甲基化测序发现RBBP5基因功能丧失可以引起DNA甲基化水平的改变。Rbbp5-/-小鼠可能在胚胎期死亡。本研究结果提示RBBP5对胚胎发育至关重要，RBBP5基因突变可能是先天性阴道发育不全的致病原因，为临床遗传诊断和甲基化检测的应用提供了分子基础。