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摘要第一部分 慢性应激和动脉粥样硬化动物模型的构建及脑组织核心基因的识别<br>　　目的:本研究拟构建慢性应激(Chronic stress,CS)和动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)动物模型，分析脑组织中差异性表达的基因并识别核心基因，为探究CS促进AS进展的中枢机制提供理论基础。<br>　　方法:共60只无特定病原体(Specific pathogen free,SPF)级C57BL/6J雄性小鼠分成四组，每组各15只，野生型小鼠普通饲料、普通环境喂养为对照组(CON组)，野生型小鼠普通饲料喂养、慢性应激干预为慢性应激组(CS组)，载脂蛋白E基因缺陷(Apolipoprotein E-deficient，ApoE-/-)小鼠高脂饮食、普通环境喂养为动脉粥样硬化组(AS组)，ApoE-/-小鼠高脂饮食、慢性应激干预为动脉粥样硬化叠加慢性应激组(AS+CS组)。高架十字迷宫(Elevated plus maze，EPM)及开放旷场(Open field,OF)实验用于慢性应激模型的评价。应用转录组测序技术及生物信息学方法分析小鼠脑组织中差异性基因的表达，采用基因本体(Gene Ontology,GO)注释和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析对差异性表达的基因进行功能富集分析。构建蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction,PPI)网络，应用 BottleNeck、MCC、Degree 及 Closeness 算法筛选核心基因。<br>　　结果:未予慢性应激干预时，CON组与CS组相比、AS组与AS+CS组相比，小鼠进入EPM开放臂次数百分比以及进入OF中心区域的次数无明显差别(P＞0.05)。慢性应激干预3个月后，与CON组相比，CS组小鼠进入EPM开放臂次数百分比显著降低(t=2.371，P=0.034)，进入OF中心区域的次数明显下降(t=2.295,P=0.032);另外，与AS组相比，AS+CS组小鼠进入EPM开放臂次数百分比及OF中心区域的次数都显著减少(t=2.170,P=0.041;t=2.079,P=0.0495)。与 CON 组相比，在 AS+CS组小鼠脑组织中共检测到437个基因呈现显著的差异性表达，其中310个基因上调，127个基因下调。GO分析表明这些基因主要富集在神经递质转运、中枢神经系统神经元、G蛋白偶联受体结合、通道和转运体复合体及活性上;KEGG通路分析显示基因主要富集在神经活性配体-受体相互作用上。PPI网络共包括290个节点及697个相互作用关系，韦恩图将4种算法筛选的蛋白和相互作用取交集后识别出2个对应的核心基因，为C-X-C基序趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)及鸟嘌呤核苷酸结合蛋白γ亚基 4(Guanine nucleotide-binding protein gamma subunit 4,GNG4),两种基因在AS+CS组小鼠脑组织中的表达较对照组上调。<br>　　结论:与正常对照相比，动脉粥样硬化叠加慢性应激组小鼠脑组织的基因表达谱存在差异，差异性表达的基因主要涉及多种通道复合体、转运体复合体和神经活性配体-受体相互作用。Cxcr4与Gng4是动脉粥样硬化叠加慢性应激的核心基因，两种基因在AS+CS组小鼠脑组织中的表达上调，可能参与了动脉粥样硬化和慢性应激的发生发展。<br>　　第二部分 慢性应激对脑组织中CXCR4与GNG4表达的影响及其与动脉粥样硬化的相关性研究<br>　　目的:在本研究第一部分内容中通过转录组学分析识别出小鼠脑组织中Cxcr4与Gng4是动脉粥样硬化叠加慢性应激的核心基因，本部分研究拟基于小鼠慢性应激模型，探究慢性应激对于脑组织中CXCR4与GNG4 mRNA和蛋白表达的影响及其与动脉粥样硬化的相关性。<br>　　方法:共48只SPF级C57BL/6J雄性小鼠分成四组，分别为对照组（CON组），慢性应激组（CS组），动脉粥样硬化组（AS组），动脉粥样硬化叠加慢性应激组（AS+CS组），每组12只。通过甲苯胺蓝染色及苏木素-伊红染色检测各组小鼠脑组织及腹主动脉切片的病理形态学变化。应用超高分辨率小动物超声成像系统测量小鼠腹主动脉内中膜厚度（Intima-media thickness,IMT）及管腔直径（Abdominal aorta lumen diameter,AUD）。实时定量逆转录聚合酶链式反应、免疫组织化学及免疫荧光染色用于检测脑组织中CXCR4与GNG4 mRNA和蛋白表达，双重免疫荧光染色用于识别CXCR4与GNG4的细胞定位。应用相关性分析及神经网络模型评估Cxcr4与Gng4 mRNA水平和腹主动脉IMT、AUD的相关性及预测价值。利用免疫共沉淀反应及蛋白与蛋白的分子对接分析探究CXCR4与GNG4的相互作用。应用蛋白质印迹（Western blotting,WB）检测脑组织中CXCR4与GNG4及凋亡相关蛋白的表达。<br>　　结果:（1）CS组与CON组相比，AS+CS组与AS组相比可见小鼠脑皮质区结构疏松;（2）CS组与CON组相比，AS+CS组与AS组相比小鼠脑组织中CXCR4与GNG4 mRNA和蛋白的表达水平均显著升高（均P＜0.001）;（3）CS组与CON组相比，AS+CS组与AS组相比可见腹主动脉血管结构受损，IMT明显增加，AUD明显减低（均P＜0.01）,另外，Cxcr4与Gng4 mRNA的表达水平和IMT均呈显著的正相关（r=0.874;r=0.881），与 AUD 均呈明显负相关（r=-0.881;r=-0.886），Cxcr4的表达水平与Gng4的表达水平呈显著的正相关（r=0.936）（均P＜0.0001），且Cxcr4联合Gng4对于腹主动脉IMT及AUD均具有良好的预测能力;（4）CXCR4与GNG4间存在细胞共定位和相互作用关系，能够形成结构较为稳固的复合体（CXCR4/GNG4）,且CXCR4与GNG4均主要在神经元中表达;（5）WB的结果提示CS组与CON组相比，AS+CS组与AS组相比，脑组织中CXCR4与GNG4蛋白水平均显著增加，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3）、Caspase-9 及活化的 Caspase-3（Cleaved Caspase-3）、Cleaved Caspase-9的表达均明显下调（均P＜0.0001）。<br>　　结论:CS可能在一定程度上破坏了脑组织结构层次的完整性并促进腹主动脉AS的进展，并且CS能够上调小鼠脑组织中CXCR4与GNG4 mRNA和蛋白的表达。表达上调的Cxcr4与Gng4 mRNA水平和AS的严重程度均呈显著的正相关且两者联合对于AS严重程度具有良好的预测能力。脑组织中Cxcr4 mRNA与Gng4 mRNA的表达呈显著的正相关，在蛋白水平上，CXCR4与GNG4均主要在神经元中表达，两者存在细胞共定位及相互作用关系，能够形成结构较为稳固的复合体。此外，CS抑制了 Caspase-9和Caspase-3的表达，Caspase-9/Caspase-3依赖凋亡途径可能和CXCR4与GNG4蛋白的表达上调有关。<br>　　第三部分 血清CXCR4与GNG4水平和颅内动脉粥样硬化性狭窄的关系及颅内动脉粥样硬化性狭窄诊断模型的构建<br>　　目的:本研究第二部分内容中发现动脉粥样硬化（AS）能够上调小鼠脑组织中CXCR4与GNG4 mRNA和蛋白的表达水平，本部分内容拟探讨缺血性脑血管病（Ischemic cerebrovascular disease,ICVD）患者血清中 CXCR4 与 GNG4 蛋白水平与颅内动脉粥样硬化性狭窄（Intracranial atherosclerotic stenosis,ICAS）的关系，评估其对于ICAS的诊断价值，构建ICAS的诊断预测模型并对模型进行时间验证。<br>　　方法:连续性纳入自2022年3月至2023年4月于北京医院神经内科住院治疗的缺血性脑血管病患者。应用颅内动脉检查（MRA、CTA或DSA）评估患者颅内动脉粥样硬化情况，将患者分为ICAS组（颅内动脉狭窄≥50％）和对照组（颅内动脉狭窄＜50％）,检测两组患者的血清CXCR4与GNG4蛋白水平，通过相关性分析及多因素分析探讨CXCR4与GNG4水平和ICAS的相关性。根据颅内动脉狭窄程度将ICAS组患者进一步分为中度狭窄组（50％≤颅内动脉狭窄＜70％）及重度狭窄组（70％≤颅内动脉狭窄≤100％）,根据本次入院是否发生急性缺血事件将ICAS组进一步分成症状性颅内动脉粥样硬化性狭窄（Symptomatic ICAS，sICAS）和非sICAS组，比较各组间CXCR4与GNG4水平的差异。构建受试者工作特征（Receiver operating characteristic,ROC）曲线，评估 CXCR4 与 GNG4 对于 ICAS 的诊断预测价值。根据受试者血清样本采集时间将受试者划分为训练集（2022年3月至2022年12月）和验证集（2023年1月至2023年4月），将多因素Logistic回归分析中差异有统计学意义的因素纳入模型的构建，应用曲线下面积（Area under the curve，AUC）、校准曲线、Hosmer-Lemeshow拟合优度检验和决策分析曲线（Decision curve analysis,DCA）评估模型的性能，并在总体人群中探究预测模型对于重度ICAS、sICAS及中重度缺血性卒中（美国国立卫生研究院卒中量表评分≥5分）的预测价值，AUC＞0.7认为模型具有较好的区分能力。<br>　　结果:共纳入ICVD患者264例，其中ICAS组173例[男125例;年龄(69.05±11.06)岁]，对照组 91 例[男 56 例;年龄(66.96±11.12)岁]。ICAS 组 CXCR4[(320.00±46.90)ng/L 比(304.00±51.54)ng/L,t=2.472,P=0.014]与 GNG4 的水平[(1546.48±239.82)ng/L 比(1452.84±253.99)ng/L，t=2.902,P=0.004]均高于对照组，CXCR4与GNG4水平上调与ICAS均具有显著的相关性(r=0.155,P=0.011;r=0.180,P=0.003),另外血清CXCR4水平和GNG4水平也呈显著的正相关(r=0.171，P=0.005)。校正相关混杂因素后，Logistic回归分析结果提示血清CXCR4水平、GNG4水平升高(OR=1.006,95％CI:1.001～1.012,P=0.031;OR=1.001,95％CI:1.000～1.002,P=0.018),既往合并糖尿病病史(OR=2.343,95％CI:1.346～4.078,P=0.003)及高纤维蛋白原/白蛋白比值(Fibrinogen-to-albumin ratio,FAR)(OR=1.210,95％CI:1.046～1.399,P=0.010)是ICAS的独立影响因素。ICAS中度狭窄组，重度狭窄组及对照组间CXCR4与GNG4水平差异有统计学意义(F=5.527,P=0.004;F=6.813,P=0.001)，ICAS重度狭窄组患者血清中CXCR4水平明显高于对照组[(324.82±45.87)ng/L 比(304.00±51.54)ng/L,t=3.132,P=0.002]及 ICAS 中度狭窄组[(324.82±45.87)ng/L 比(307.47±47.72)ng/L,t=2.118,P=0.035]，血清中 GNG4 水平在ICAS 重度狭窄组患者中[(1571.50±240.09)ng/L]较对照组[(1452.84±253.99)ng/L]及中度狭窄组[(1481.32±228.91)ng/L]也显著提高(t=3.543,P＜0.001;t=2.185,P=0.030);血清CXCR4与GNG4水平和ICAS狭窄程度均存在显著的正相关(r=0.194,P=0.002;r=0.219,P＜0.001)。与非sICAS组相比，sICAS组血清CXCR4与GNG4的水平明显升高[(325.74±46.22)ng/L 比(307.37±46.32)ng/L,t=2.420,P=0.017;(1624.81±215.38)ng/L 比(1373.85±198.09)ng/L,t=7.277,P＜0.001],另外血清 CXCR4与GNG4水平上调和sICAS均具有显著的相关性(r=0.182,P=0.017;r=0.486,P＜0.001)。血清CXCR4与GNG4水平对ICAS具有一定的预测价值，能够提高诊断ICAS的区分能力(P=0.038)。基于血清CXCR4与GNG4水平，伴有糖尿病病史以及FAR构建ICAS诊断预测模型，训练集中AUC为0.711(95％CI:0.636～0.787),验证集中AUC为0.707(95％CI:0.576～0.838),此外，模型对于重度ICAS(AUC 0.705,95％CI0.641-0.768),sICAS(AUC 0.767,95％CI0.708-0.826)和中重度缺血性卒中(AUC0.702,95％CI0.610-0.793)均具有良好的区分度。<br>　　结论:(1)在缺血性脑血管病患者中，与对照组相比，ICAS组患者血清中CXCR4与GNG4的水平明显升高，二者均与ICAS具有显著的相关性，CXCR4与GNG4的水平呈明显的正相关，另外，CXCR4与GNG4水平在重度ICAS组及sICAS组患者中均显著升高，并且CXCR4与GNG4水平上调与ICAS狭窄程度及sICAS均呈显著的正相关;(2)血清CXCR4与GNG4水平升高，既往合并糖尿病病史及高FAR是ICAS的独立影响因素，应用上述四个因素构建的ICAS诊断预测模型在本中心样本中展现了较好的预测效能，并且模型对于重度ICAS、sICAS及中重度缺血性卒中均具有较好的区分能力。