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摘要背景与目的<br>　　红系发生(erythropoiesis)是造血发生(hematopoiesis)过程中重要的分支，成熟红细胞的产生对维持机体正常生理功能具有重要意义。红系发生过程受到细胞内外多种因素的调控。长链非编码RNA(long non-coding RNA)在此过程中的研究并不很充分。现有研究发现，miR-144/451在红系发生过程中扮演重要角色。本实验室已构建的miR-144/451_GFP-H1人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hESC),通过GFP荧光报告基因的表达情况追踪miR-144/451表达以描述红系发生情况，同时筛选出红系发生功能相关的lncRNA,探索lncRNA在红系发生过程中的潜在功能并初步验证其功能影响。<br>　　实验方法<br>　　(1)利用已构建的miR-144/451_GFP-H1 hESC进行体外红细胞诱导分化，以CD71，GPA表面分子描述进入红系发生阶段的细胞亚群。以miR-144的GFP报告基因为关键区分，对GFP阳性(高红系发生倾向)和阴性细胞群(低红系发生倾向)分别进行转录组测序，获取差异性表达的lncRNA。<br>　　(2)选取具备验证价值的lncRNA条目进行初步功能验证。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术设计对应lncRNA的功能干扰方案，并获取对应lncRNA功能敲除的miR-144/451_GFP-H1 hESC。使用该敲除细胞株与非敲除的 miR-144/451_GFP-H1 hESC进行红细胞的平行诱导培养，寻找差异节点，初步验证其对在体外发育模型下对红系发生的影响效应。<br>　　实验结果<br>　　(1)构建的miR-144/451_GFP-H1细胞株能够在进入体外红细胞诱导阶段后表达GFP荧光蛋白，提示miR-144的启动。<br>　　(2)在CD71，GPA双阳群中，GFP阳性亚群和GFP阴性亚群存在显著的lncRNA表达差异。<br>　　(3)对多个lncRNA条目设计了能够有效干扰其功能的序列区段敲除基因编辑方案并验证编辑成功。在敲除细胞株中，lncRNA的一部分序列被直接敲除。<br>　　(4)在红细胞诱导培养的平行验证试验中，LINC01569的功能敲除株对比非敲除株，流式检测表现出明显的亚群差异和细胞增殖能力差异:<br>　　a.敲除株的GFP荧光持续高表达;<br>　　b.敲除株CD71-GPA双阳群在红细胞成熟过中比例持续降低;<br>　　c.敲除株未观察到显著的血红蛋白表达，无明显红色;<br>　　d.敲除株细胞增殖能力远低于非敲除株。(P＜0.05)<br>　　实验结论<br>　　1.成功利用miR-144/451_GFP-H1细胞株对lncRNA在红系发育中的潜在功能进行了探究，可设计更精密的体外发育实验来提高lncRNA功能的抓取精度。<br>　　2.在差异性表达的lncRNA条目中，LINC01569经初步验证，对红系发生过程存在调控作用。LINC01569的功能缺失严重影响红细胞的正常分化与增殖。<br>　　3.LINC01569在红系发生过程中的具体调控机制有待进一步探索与研究。