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摘要研究背景和目的<br>　　慢性心力衰竭的治疗方法有限且预后较差，其根本原因在于心梗后心肌细胞的大量丢失。心肌细胞的增殖活性随年龄的增长不可逆的迅速降低，直至成年后心肌细胞永久性地退出细胞周期，只有极少部分的心肌细胞在进行增殖。治疗终末期冠心病时亟需解决的关键问题在于如何实现心肌细胞的有效再生。目前诱导心脏再生主要包含以下两种策略:1.外源性补充心肌祖细胞诱导其分化形成心肌细胞;2.内源性诱导心肌细胞重新进入细胞周期，促进心肌细胞增殖。然而，越来越多的临床试验显示，外源性移植具有自我增殖分化潜能的祖细胞的策略，虽然在一定程度上能够改善心梗后心衰患者的心功能，但未能有效地改善其预后。内源性心肌再生由于无免疫排斥及更能顺应生理发展模式，受到广泛的关注。既往研究表明，非编码RNA(ncRNA)在这一方面起到了至关重要的作用。<br>　　长链非编码RNA(lncRNA)被定义为缺乏开放阅读框的调节性非编码RNA分子，是ncRNA家族中的一类长度大于200bp核苷酸且不编码蛋白质的RNA分子。由于缺乏开放阅读框，它们最初被认为没有基因转录的生物学功能而被学者忽视。近年来研究发现，，lncRNA参与了多种生物学进程，其在细胞正常生理或病理状态下行使了重要的调控功能，与疾病发展密切相关。近期研究显示，lncRNA在心脏发育和多种疾病中发挥着重要作用。因此，探索lncRNA干预心肌细胞，使其重新进入细胞周期，将为治疗急性心肌梗死后促进心肌细胞再生修复提供新靶点，成为心脏修复及抗重塑的治疗新策略。<br>　　缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是HIF的一个亚单位，一种广泛存在于哺乳动物和人体内的转录因子。既往研究已经证明，HIF-1α能够增强癌细胞中的瓦氏效应，促进癌细胞的增殖。在心肌中的研究表明，HIF-1α能够调控胎鼠心脏的代谢类型进而促进胎鼠心脏的生长发育。<br>　　在近年来的研究表明，lincRNA-p21在心血管疾病中也发挥了重要的作用，如lincRNA-p21可通过调控P21的活性来促进血管平滑肌细胞的增殖。其次，lincRNA-p21作为一种缺氧反应诱导的lncRNA，通过调节HIF-1α蛋白，在瓦氏效应中也起到至关重要的作用。然而，lincRNA-p21是否在心肌细胞分裂增殖中发挥重要作用目前尚不清楚。<br>　　在本研究中，我们探索了lincRNA-p21是否可能通过调控HIF-1α的稳定性，进而促进心肌细胞的增殖。本项目拟:1.探索lincRNA-p21在各组织及各细胞中的基础表达情况以及其在心肌细胞中的亚细胞定位;2.通过过表达/敲低lincRNA-p21来探索其是否参与心肌细胞增殖;3.探索lincRNA-p21能否促进心梗后心肌细胞增殖以及能否改善心梗后的心功能;4.探索lincRNA-p21在心肌细胞增殖中的分子调控机制。该项目或能为治疗急性心肌梗死后促进心肌细胞再生修复提供新靶点，成为心脏修复及抗重塑的治疗新策略。<br>　　材料与方法<br>　　1.主要实验材料<br>　　1.1实验动物<br>　　健康的C57BL/6J1天、3天、7天、14天龄新生乳鼠及8周龄成年小鼠。本实验中所用的实验动物均购买自南方医科大学的实验动物中心;所有的动物操作已获本校动物委员会及伦理委员会批准。实验动物的饲养及管理严格按照按美国国立卫生院(NationalInstitutesofHealth,NIH)“theguideforthecareanduseofLaboratoryanimals”的规定执行。<br>　　1.2主要设备<br>　　超净工作台、二氧化碳细胞培养箱、37℃水浴箱、超声检测仪、常规离心机、激光共聚焦显微镜、4℃离心机、常规离心机、罗氏480RT-PCR机等。<br>　　1.3主要实验试剂<br>　　EdU检测试剂盒、DMEM/F12培养基、小鼠cTnT一抗抗体、RNA提取试剂盒、1ncRNA原位杂交试剂盒、SYBRGreenPCRMasterMix试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒等。<br>　　2.实验方案<br>　　2.1探索lincRNA-p21在各组织、各类型细胞中的基础表达情况及其在心肌细胞中的亚细胞定位<br>　　(1)通过RT-PCR来探索lincRNA-p21在不同年龄的心脏组织、不同年龄的心肌细胞、不同的细胞类型及不同的组织中的表达情况差异。<br>　　(2)通过原位杂交实验探索lincRNA-p21在心肌细胞中的主要分布位置。<br>　　2.2探索调控lincRNA-p21水平对心肌细胞增殖的影响<br>　　(1)通过转染干扰片段siRNA(si-lincRNA-p21)至体外分离的1天龄乳鼠心肌细胞，免疫荧光标记细胞增殖指标EdU、pH3来明确敲低lincRNA-p21后1天龄乳鼠心肌细胞的增殖情况。<br>　　(2)通过转染质粒至体外分离的7天龄乳鼠心肌细胞，免疫荧光标记细胞增殖指标EdU、pH3、AuroraB来明确过表达lincRNA-p21后7天龄乳鼠心肌细胞的增殖情况。<br>　　(3)通过对成年小鼠心肌内注射腺相关病毒AAV9,免疫荧光标记EdU、pH3来明确过表达lincRNA-p21后成年鼠心肌细胞的增殖情况。<br>　　2.3探索lincRNA-p21能否促进心肌梗死(MI)后的心肌修复和再生<br>　　(1)永久结扎6-8周龄雄性C57小鼠的冠脉左前降支以构建小鼠心梗模型，并分别在对照组与过表达lincRNA-p21组的梗死区域周围多点注射腺相关病毒AAV9-NC或AAV9-lincRNA-p21。28天后，通过免疫荧光标记EdU、pH3来明确过表达lincRNA-p21对成年小鼠心梗后心肌细胞增殖的影响。<br>　　(2)永久结扎6-8周龄雄性C57小鼠的冠脉左前降支以构建小鼠心梗模型，并分别在对照组与过表达lincRNA-p21组的梗死区域周围多点注射腺相关病毒AAV9-NC或AAV9-lincRNA-p21。28天后，通过M型心脏超声检测成年小鼠心梗后心功能的恢复。<br>　　2.4探索lincRNA-p21下游作用分子及参与的信号转导通路<br>　　(1)探究lincRNA-p21能否调控HIF-1α的mRNA及蛋白质水平。<br>　　(2)探究lincRNA-p21能否通过调控HIF-1α稳定性调控心肌细胞增殖。<br>　　结果<br>　　1.lincRNA-p21在乳鼠心脏中高表达，并且主要表达在心肌细胞细胞浆;<br>　　2.体外敲低lincRNA-p21可以抑制1天龄乳鼠心肌细胞增殖，体外过表达lincRNA-p21可促进7天龄乳鼠心肌细胞增殖;<br>　　3.体内过表达lincRNA-p21可促进成年小鼠心肌细胞增殖;<br>　　4.lincRNA-p21可促进心肌梗死后的心肌再生，并改善心功能;<br>　　5.lincRNA-p21可通过提高HIF-1α的稳定性，促进心肌细胞的增殖。<br>　　结论<br>　　过表达lincRNA-p21能够有效的促进心肌细胞增殖，并能够在心梗后促进心脏修复和改善心脏功能，这一改善或与提高HIF-1α的稳定性有关。