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摘要碳和氮是所有生命体中最基本的两种元素，碳氮代谢平衡对微生物的生存至关重要。蓝细菌作为一种古老的光合自养型原核生物，进化出一系列复杂的碳氮代谢调控网络。其中，α-酮戊二酸(2-OG)作为偶联碳氮代谢的核心效应分子，可以被多种转录因子(包括NtcA和NdhR),以及信号蛋白PⅡ感应。<br>　　PⅡ蛋白是目前分布最广泛的信号蛋白家族之一。在蓝细菌中PⅡ通过结合多种靶蛋白，协同调控碳氮平衡。在铵盐缺乏的情况下，蓝细菌可以通过硝酸盐同化通路（nirA操纵子)将硝酸盐/亚硝酸盐转运到细胞内并还原为铵，从而为蓝细菌的生长提供氮源。PⅡ被认为通过与硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白NrtABCD互作进而调控硝酸盐同化通路的活性。NrtABCD是一种ATP结合盒式(ABC)超家族转运蛋白，属于Ⅰ型ABC内向转运蛋白，由一个底物结合蛋白SBP(NrtA)、两个跨膜亚基TMD(NrtB)和两个核苷酸结合亚基NBD(NrtC和NrtD)组成。与其他ABC转运蛋白不同，NrtABCD的NrtC亚基融合了一个与NrtA有30％序列一致性的C端调控结构域(CRD),该结构域被认为参与硝酸盐的转运调控。目前，关于这种新型ABC转运蛋白的结构和转运机理，以及PⅡ如何识别NrtABCD进而调控蓝细菌碳氮代谢平衡的分子机理仍不清楚。<br>　　本研究利用单颗粒冷冻电镜技术解析了三种不同状态的NrtBCD的三维结构，包括结合底物硝酸根的NrtBCD-NO3-、结合Mg2+-ATP的NrtBCD-ATP以及结合PⅡ的NrtBCD-PⅡ,分辨率分别为3.5、3.1和3.5?。<br>　　NrtBCD-NO3-结构呈向内开口(inward-facing)的构象，两个NBD处于半开放状态，两个TMD向胞质侧开口。在TMD中，一个硝酸根分子结合在由亮氨酸残基围成的疏水腔中，疏水腔的下方存在一个富含精氨酸残基的亲水腔，两者共同组成了一个连续的底物转运通道。<br>　　在NrtBCD-ATP的结构中，ATP结合引发NBD相互靠近，导致TMD发生构象变化，底物转运通道被封闭，形成向外开口的封闭(outward-facingoccluded)构象。在NrtBCD-NO3-和NrtBCD-ATP结构中，CRD均是不可见的，表明其处于柔性摆动状态。<br>　　在NrtBCD-PⅡ复合物中,NrtBCD整体处于抑制型向内开口(inhibitedinward-facing)的构象。与以前报道的PⅡ通过T-loop结合靶蛋白的方式不同，PⅡ通过核心结构域中的T-loop基部、B-loop和C-loop等元件同时结合NrtC的NBD和CRD结构域，从而稳定了CRD结构域。与NrtBCD-NO3-和NrtBCD-ATP的结构相比，PⅡ结合NrtBCD导致TMD中硝酸根转运通道变窄，底物无法进入通道进<br>　　而抑制转运活性。硝酸盐吸收实验表明，在铵盐存在情况下，PⅡ完全抑制了蓝细菌Synechocystissp.PCC6803的硝酸盐吸收，而突变NrtC中与PⅡ相互作用的残基可以部分恢复硝酸盐吸收活性，进一步证明PⅡ通过结合NrtC进而调控NrtABCD的活性。而突变CRD的硝酸根结合位点对于PⅡ介导的硝酸盐吸收调控没有影响，暗示硝酸根并不直接参与PⅡ对NrtABCD的活性调控。<br>　　基于结构和生化分析以及生理实验，本研究提出了PⅡ通过结合不同效应分子精细调控NrtABCD活性的分子机制模型。在高N/C比时，ADP或ATP结合状态的PⅡ通过直接结合NrtC与NrtABCD形成复合物，将NrtABCD锁定在抑制型向内开口的构象，NrtABCD的硝酸盐转运活性被抑制。而在低N/C比时，细胞内累积的2-OG结合PⅡ导致PⅡ发生构象变化，使其从NrtC上解离下来，NrtABCD转运活性得以恢复，向胞内转运硝酸盐，维持碳氮平衡。该模型阐明了NrtABCD介导的底物识别、转运和释放的具体过程，以及PⅡ变构调控NrtABCD转运活性的分子机理。本研究不仅揭示了蓝细菌硝酸盐转运和调控的精细分子机制，还发现了信号蛋白PⅡ与靶蛋白的一种新型互作模式。此外，本研究还揭示了一种非对称的ABC转运蛋白的调控模式，拓展了蓝细菌的碳氮代谢平衡调控网络。