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摘要研究背景:肠道病毒C组96型(EnterovirusC96,EV-C96)是一种新型肠道病毒，原型株(BAN00-10488)于2000年分离自孟加拉国。近年来中国云南、新疆、西藏及山东等地也均有报道。虽然关于EV-C96的报道有所增加，但目前尚缺乏关于全球EV-C96的分子流行病学及生物学特性的系统研究。<br>　　研究目的和意义:通过收集EV-C96中国分离株，结合GenBank中全球EV-C96序列构建数据集，进行标准化基因分型，基因特征、起源进化、地理传播路径、基因重组模式的分析。除此之外，对EV-C96分离株在不同细胞的噬性表型特征进行分析。研究结果丰富了全球EV-C96的基因序列库，并为EV-C96致病机制的研究提供一定的科学数据。<br>　　研究方法:<br>　　1.序列测定及数据库的建立:通过中国脊髓灰质炎网络实验室和手足口病网络实验室共收集得到17株EV-C96中国分离株，分别分离于1997-2020年全国7个省。然后进行VP1区扩增和核苷酸序列测定，使用引物步行法进行全基因组序列测定。最后，通过与GenBank中的EV-C96序列信息进行整合筛选，建立了由26条EV-C96全基因组序列和36条全长VP1区序列组成的序列数据库。<br>　　2.生物信息学分析:序列经Sequencher软件拼接得到全基因组序列;使用BioEdit软件进行核苷酸和氨基酸相似性比较和氨基酸熵值分析;使用MEGA软件构建基于VP1区序列的系统发生树，计算遗传距离，并进行基因型划分;使用BEAS工程序基于贝叶斯原理，进行起源进化及传播路径分析;使用Simplot软件进行重组分析;通过Datamonkey在线分析程序进行选择压力分析。<br>　　3.细胞实验:将通过噬斑纯化后的EV-C96毒株分别接种于人横纹肌肉瘤细胞(RD)和人喉癌上皮细胞(HEp-2)，通过荧光定量RT-PCR检测及测定不同时间点的病毒滴度来比较EV-C96在不同细胞上的生长特性。<br>　　4.动物实验:选取在不同细胞上生长的EV-C96毒株，通过肌肉注射和颅内注射感染ICR乳鼠和A129乳鼠，观察并准确记录感染后每只乳鼠的体重、死亡率及临床评分等;分别取肌肉、脑、肺、肝等组织进行病毒滴度测定，通过苏木素-伊红染色进行组织病理学检测。<br>　　研究结果:<br>　　1.本研究基于全长VP1序列核苷酸遗传距离在15％～25％的标准，将全球EV-C96划分为A-O共15个基因型，中国株分布于其中9个基因型。所有EV-C96基因型组内核苷酸遗传距离为0.056～0.149,各基因型组间遗传距离为0.156～0.291。<br>　　2.全球EV-C96平均进化速率为5.16×10-3substitution/site/year，中国EV-C96平均进化速率为4.73×10-3substitution/site/year。推测全球EV-C96最早共同祖先(themostrecentcommonancestor,MRCA)约为1925年，而中国EV-C96株的MRCA约为1927年。<br>　　3.根据现有的序列信息，推测目前EV-C96在全球存在7条具有贝叶斯因子(Bayesfactor,BF)支持的传播路径，在中国存在8条具有BF支持的迁移路径。<br>　　4.全球EV-C96具有7种重组模式，大多与其他EV-C存在重组信号，重组位点覆盖5''-UTR区、P2区及P3区。<br>　　5.VP1-105位点可能为正向选择位点，其突变频率较高，氨基酸熵值分析发现2A区突变最频繁。<br>　　6.本研究中11株EV-C96在RD细胞和HEp-2细胞中生长情况不同。有3株只能在RD细胞中生长，并产生特征性的肠道病毒致细胞病变效应(Cytopathiceffect,CPE)，有6株只能在HEp-2细胞中生长并产生CPE,另外2株可以同时在两种细胞中生长，但只在HEp-2细胞中产生CPE,而在RD细胞中无明显CPE，仅仅核酸检测显示阳性。同一个基因型或同种重组模式的EV-C96其细胞噬性的表型特征不完全相同。<br>　　7.EV-C96对ICR乳鼠没有致病性，但对A129小鼠有明显的致病性，且不同EV-C96株在A129乳鼠上的致病力有差异。致病性表现为乳鼠体重下降，后肢肌瘫痪及死亡。在骨骼肌、脊髓、脾、肝、血、肺组织中均检测出活病毒，其中骨骼肌组织中病毒滴度最高。苏木素-伊红染色显示骨骼肌和肺组织出现明显的病理改变。但致病力的差异与细胞噬性的表型特征不完全对应。<br>　　研究结论:<br>　　1.目前全球EV-C96可划分为15个基因型，中国株分布于9个基因型。EV-C96在全球和中国的进化速率相近，推测其起源于1920s。EV-C96中国株与其他EV-C存在明显的重组信号。VP1-105位点可能为正向选择位点，其突变频率较高。<br>　　2.EV-C96具有不同的细胞噬性，但与不同基因型、不同重组模式无关联，与在A129乳鼠上的致病力也不完全对应。<br>　　3.EV-C96可以感染A129乳鼠，但不感染ICR乳鼠。感染A129乳鼠后，乳鼠出现体重下降、双下肢瘫痪和死亡，在骨骼肌等组织中可检测出活病毒，并出现明显的病理改变，因此可作为EV-C96的动物感染模型。