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摘要研究背景:阿霉素是白花链霉菌突变菌株的次级代谢产物，属于蒽环类家族，具有高抗肿瘤疗效，可用于急性白血病、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多种癌症治疗，然而，其心脏毒性限制了临床应用。心肌肥厚是阿霉素常见的心脏毒性表现之一，广泛定义的心肌肥厚是一种通过增加心肌质量来适应血压上升或血容量增加的心肌增长，这是一种产生缓慢但有效的代偿功能。长期压力过重时，虽然心肌总量增加，心脏收缩力增强，但冠状动脉供血量仍无法满足，导致心肌长期缺血，产生了病理性心肌肥厚，其特征是心肌细胞增大，心脏收缩能力受到阻碍，并伴有心肌细胞的内部变化，包括凋亡、心肌纤维化等。内质网作为细胞中最大的细胞器，在蛋白质合成、运输、折叠、脂质和类固醇合成、碳水化合物代谢和钙储存等方面发挥着核心作用。当内质网腔内蛋白折叠异常或钙离子平衡受到干扰时，会触发一系列反应，如蛋白质未折叠反应等内质网应激反应。这些反应是细胞应对内质网功能异常的重要机制。通过激活这些通路，细胞试图恢复内质网的正常功能或消除受损的细胞成分，以维持细胞的稳态和生存。然而，如果内质网应激持续存在或无法有效缓解，最终可能导致细胞功能紊乱或细胞死亡。研究证明阿霉素可引起心脏内质网明显扩张，内质网应激蛋白表达水平上调。心肌肥厚的出现，常常伴随着唾液酸化程度的增加。一项针对具有不同遗传背景的高血压大鼠所进行的研究表明，在分析了近两万个转录本的基因表达后，我们发现只有唾液酸转移酶7A(Siat7A)的编码基因在高血压大鼠体内出现了持续性的高水平表达。研究表明Siat7A在血管紧张素Ⅱ导致的高血压相关性心肌肥厚发展进程中，表达会持续增加，并且可以激活信号通路HIF-1α-TAK1加速心肌肥厚的产生。我们推测在阿霉素引发的心肌肥厚中Siat7A与内质网应激是否存在关联？Siat7A在其中是否发挥作用？内质网应激以及Siat7A在心肌肥厚中的相互作用机制是什么？为解答这些问题，我们进行了相关实验研究。<br>　　材料方法:本课题组阿霉素模型SD大鼠心肌石蜡切片，使用HE染色和IHC染色，我们分别观察了心肌组织的形态变化，唾液酸转移酶7A(Siat7A)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和α-辅肌动蛋白(α-actinin)在生理盐水处理组心肌和阿霉素处理组心肌的表达差异。此外，我们还提取了RNA和蛋白质样品，利用q-PCR技术检测了Siat7A、GRP78、心房利钠肽(ANP)、前脑利钠肽(BNP)以及β-肌球蛋白重链(β-MHC)mRNA的转录水平，同时采用WesternBlot技术进一步验证了Siat7A、GRP78、50片段的转录因子6(ATF6-50)、90片段的转录因子6(ATF6-90)、ANP和α-actinin的蛋白表达情况。AC16细胞，一种具有人心肌细胞特性的细胞系，0μM、5μM、10μM、15μM阿霉素作用24h后，提取蛋白样品，用WesternBlot技术检测Siat7A、GRP78、ATF6-50、ATF6-90、ANP、α-actinin蛋白表达情况。采用慢病毒转染技术对AC16细胞进行转染并筛选稳定过表达Siat7A和敲低Siat7A的细胞系，设为Mock、OverSiat7A组，Mock、shSiat7A组。随后，我们使用0和10μM的阿霉素对这些细胞株进行24小时的处理，并提取了RNA和蛋白质样品。通过q-PCR,我们检测了Siat7A、GRP78、ANP、BNP以及β-MHCmRNA的转录水平。同时，利用WesternBlot技术，我们还进一步检测了Siat7A、GRP78、ATF6-50、ATF6-90、ANP和α-actinin的蛋白表达情况，采用免疫荧光技术检测GRP78、α-actinin的表达情况。用0mM、1mM、2mM、5mM内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)作用AC16细胞2h后，之后用10μM的阿霉素作用24h后，提取蛋白样品，用WesternBlot技术检测Siat7A、GRP78、ATF6-50、ATF6-90、ANP、α-actinin蛋白表达情况。用0mM、5mM内质网应激抑制剂4-PBA作用稳定过表达Siat7A基因的细胞株，之后用10μM的阿霉素作用24h后，提取RNA、蛋白样品，我们运用q-PCR来测定Siat7A、GRP78、ANP、BNP以及β-MHC的mRNA的转录水平，同时采用WesternBlot技术来检测Siat7A、GRP78、ATF6-50、ATF6-90、ANP以及α-actinin的蛋白表达状况。此外，我们还利用免疫荧光技术对GRP78和α-actinin的表达情况进行了观察和分析。<br>　　实验结果:在阿霉素给药SD大鼠心脏组织中，给药组心脏细胞形态发生改变，Siat7A、GRP78、α-actinin表达均升高，Siat7A、GRP78、ANPmRNA水平和蛋白水平表达增加，BNP、a-actinmRNA的转录水平也有所增加，ATF6-50蛋白水平表达增加，ATF6-90蛋白水平的表达并未呈现显著差异;0μM、5μM、10μM、15μM阿霉素作用AC16细胞24h后，10μM、15μM刺激的AC16细胞Siat7A、GRP78、ATF6-50、ANP、α-actinin蛋白水平表达增加，ATF6-90蛋白水平的表达并未呈现显著差异;敲低Siat7A细胞株，用0、10μM阿霉素作用24h后、Siat7A、GRP78、ANP的mRNA及蛋白表达水平上均表现出明显的降低，BNP、β-MHCmRNA水平表达降低，ATF6-50、α-actinin蛋白水平表达降低，ATF6-90蛋白水平的表达并未呈现显著差异，GRP78、α-actinin荧光强度减弱;过表达Siat7A细胞株，用0、10μM阿霉素作用24h后、Siat7A、GRP78、ANPmRNA水平和蛋白水平表达增加，BNP、β-MHCmRNA的转录水平也有所增加，ATF6-50、α-actinin蛋白水平表达增加，ATF6-90蛋白水平的表达并未呈现显著差异，GRP78、α-actinin荧光强度明显增强;在对AC16细胞进行0mM、1mM、2mM、5mM的4-PBA处理2小时后，再使用10μM阿霉素作用24小时，随着4-PBA处理浓度的逐步提升，我们可以明显观察到GRP78、ATF6-50、ANP以及α-actinin的蛋白表达水平呈现显著下降的趋势，Siat7A、ATF6-90蛋白水平的表达并未呈现显著差异;再对过表达Siat7A的细胞株用0mM、5mM的4-PBA作用于2小时后，再经过10μM阿霉素24小时的刺激，与未接受4-PBA处理的对照组相比，经过4-PBA处理的过表达Siat7A细胞株在GRP78和ANP的mRNA及蛋白表达水平上均表现出明显的降低，BNP、β-MHCmRNA水平表达降低，ATF6-50、α-actinin蛋白水平表达降低，Siat7AmRNA水平和蛋白水平的表达并未呈现显著差异、ATF6-90蛋白水平的表达并未呈现显著差异，GRP78、α-actinin荧光强度减弱。<br>　　实验结论:1.阿霉素导致的心肌肥厚中，内质网应激参与该心肌肥厚的发生。<br>　　2.阿霉素导致的心肌肥厚中，Siat7A参与启动内质网应激促进心肌肥厚的发生。