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摘要研究背景<br>　　心肌梗死是最常见的心血管疾病类型，严重威胁人类的健康。心肌梗死后的标准治疗方法是通过血运重建术快速恢复冠状动脉血流，但是，及时的血运重建可能会进一步加重心肌损伤，即心肌缺血再灌注损伤(Myocardialischemia-reperfusioninjury,MIRI)。其形成机制包括活性氧的大量生成、细胞钙超载、炎症反应、线粒体功能障碍等。其中，线粒体功能障碍在MIRI中起着关键作用。最近的研究表明，赖氨酸乙酰化在线粒体功能调节中起着重要作用，而SIRT3是线粒体中最重要的去乙酰化酶，它可以通过调控线粒体蛋白乙酰化来改善线粒体功能，从而延缓MIRI的进展，这提示通过SIRT3调节线粒体蛋白乙酰化改善线粒体功能障碍可能是一种潜在的治疗MIRI的方法。<br>　　中药复方双参宁心胶囊(SSNX)是中国中医科学院西苑医院基础医学研究所研发的治疗气虚血瘀证冠心病心绞痛的组分中药。课题组前期研究发现SSNX对线粒体有明确的保护作用。基于前期研究基础，本研究以线粒体蛋白乙酰化为切入点，探讨SSNX及其有效成分人参皂苷Rg1调控SIRT3介导线粒体蛋白乙酰化减轻心肌缺血再灌注损伤的作用机制。<br>　　研究目的<br>　　1.探究SSNX是否通过调控SIRT3介导线粒体蛋白乙酰化修饰减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤。<br>　　2.探究SSNX是否通过调控SIRT3介导SDHA和ATP5A1去乙酰化减轻HL-1心肌细胞缺氧/复氧损伤。<br>　　3.筛选SSNX的有效物质成分，探究人参皂苷Rg1是否通过调控SIRT3介导ATP5A1去乙酰化减轻HL-1心肌细胞缺氧/复氧损伤。<br>　　研究方法<br>　　1.SSNX调控SIRT3介导线粒体蛋白乙酰化修饰对心肌缺血再灌注损伤小鼠的保护作用研究<br>　　以C57BL/6小鼠为研究对象，实验分为假手术（Sham）组、模型（Model）组、SSNX组（180mg/kg/1d）、SSNX+3-TYP组、3-TYP组（50mg/kg/2d），通过灌胃和腹腔注射给药7d后，结扎冠状动脉左前降支，缺血45min,再灌注2h构建MIRI模型。生化分析法检测小鼠血清CK、CK-MB、LDH含量;超声心动图检测心功能;蛋白免疫印迹法检测小鼠心脏线粒体中SIRT3表达量和线粒体蛋白乙酰化水平;透射电镜观察线粒体形态变化;荧光素酶法检测心脏ATP含量;TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况。<br>　　2.SSNX调控SIRT3介导SDHA和ATP5A1去乙酰化对缺氧/复氧损伤HL-1心肌细胞的作用机制研究<br>　　CCK-8法检测细胞活力，检测SSNX细胞毒性，并筛选SSNX对H/R损伤HL-1细胞的最佳保护浓度。<br>　　将HL-1心肌细胞分为正常组（Control）、模型组（Model）、SSNX组（12.5μg/mL）、SSNX+siSIRT3组。细胞以0.5×105个/mL密度接种在6孔板，12h后观察细胞融合度达到50-60％左右，用siSIRT3转染HL-1心肌细胞，36h后构建H/R模型。造模结束后，取细胞培养上清测量LDH含量;免疫共沉淀测定SDHA和ATP5A1的乙酰化水平;SeahorseXFp检测线粒体耗氧率评估线粒体呼吸功能;荧光素酶法测定ATP含量;流式细胞术检测心肌细胞凋亡率。<br>　　3.人参皂苷Rg1调控SIRT3介导ATP5A1去乙酰化对缺氧/复氧损伤HL-1心肌细胞的保护作用机制研究<br>　　将SSNX入血成分分别与SIRT3进行分子对接，筛选出与SIRT3结合力最强的单体成分，CCK-8法检测细胞活力，检测人参皂苷Rg1细胞毒性，并筛选人参皂苷Rg1对H/R损伤HL-1细胞的最佳保护浓度。<br>　　将HL-1心肌细胞分为正常组（Control）、模型组（Model）、人参皂苷Rg1组（200μmol/L）、人参皂苷Rg1+siSIRT3组。细胞以0.5×105个/mL密度接种在6孔板，12h后观察细胞融合度达到50-60％左右，用siSIRT3转染HL-1心肌细胞，36h后构建H/R模型。造模结束后，取细胞培养上清测量LDH含量;蛋白免疫印迹法检测SIRT3表达量和线粒体蛋白乙酰化水平;免疫共沉淀测定ATP5A1的乙酰化水平;采用液质联用（LC-MS/MS）分析人参皂苷Rg1调控H/R损伤HL-1细胞中ATP5A1的乙酰化位点;构建模拟乙酰化/去乙酰化状态的ATP5A1基因过表达质粒，SeahorseXFp检测ATP5A1乙酰化/去乙酰化状态对线粒体呼吸功能的影响;荧光素酶法测定ATP含量;流式细胞术检测心肌细胞凋亡率。<br>　　研究结果<br>　　1.SSNX通过调控SIRT3介导线粒体蛋白乙酰化修饰减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤<br>　　与假手术组比较，模型组CK、CK-MB、LDH含量升高（P＜0.01），心功能指标EF、FS降低，LVIDd和LVIDs升高（P＜0.01），SIRT3表达量降低（P＜0.01），线粒体蛋白乙酰化水平升高（P＜0.05），线粒体出现肿胀变形，ATP含量减少（P＜0.01），心肌细胞凋亡率增加（P＜0.01）;与模型组比较，SSNX（180mg/kg）组CK、CK-MB、LDH含量降低（P＜0.01），EF、FS升高，LVIDd和LVIDs降低（P＜0.05或P＜0.01）,SIRT3表达量升高（P＜0.01），线粒体蛋白乙酰化水平降低（P＜0.05），线粒体损伤程度减轻，ATP含量升高（P＜0.01）;心肌细胞凋亡减少（P＜0.05）;应用SIRT3抑制剂3-TYP可减弱SSNX对MIRI小鼠的保护作用。<br>　　2.SSNX通过调控SIRT3介导SDHA和ATP5A1去乙酰化减轻HL-1心肌细胞缺氧/复氧损伤<br>　　与对照组比较，模型组LDH的漏出量升高（P＜0.01），SDHA和ATP5A1乙酰化水平升高（P＜0.05或P＜0.01），基础呼吸、ATP产生、最大呼吸、备用呼吸能力和非线粒体呼吸降低，质子漏升高，线粒体呼吸功能减弱（P＜0.01），ATP含量降低（P＜0.01），心肌细胞早期凋亡和晚期凋亡均升高（P＜0.01）;<br>　　与模型组比较，SSNX（12.5μg/mL）组LDH的漏出量降低（P＜0.01），SDHA和ATP5A1乙酰化水平降低（P＜0.05或P＜0.01），基础呼吸、ATP产生、最大呼吸、备用呼吸能力和非线粒体呼吸升高，质子漏降低，线粒体呼吸功能增强（P＜0.01），ATP含量升高（P＜0.05），心肌细胞早期凋亡和晚期凋亡均降低（P＜0.01）;<br>　　与SSNX（12.5μg/mL）组比较，SSNX+siSIRT3组模型组LDH的漏出量升高（P＜0.01），SDHA和ATP5A1乙酰化水平升高（P＜0.05或P＜0.01），基础呼吸、ATP产生、最大呼吸和非线粒体呼吸降低（P＜0.01），ATP含量降低（P＜0.01），心肌细胞早期凋亡和晚期凋亡均升高（P＜0.05）。<br>　　3.人参皂苷Rg1通过调控SIRT3介导ATP5A1氨基酸序列第2位赖氨酸去乙酰化减轻HL-1心肌细胞缺氧/复氧损伤<br>　　分子对接结果显示，人参皂苷Rg1与SIRT3结合能力最强，结合能为-10.74Kcal/mol;<br>　　与对照组比较，模型组LDH漏出量升高（P＜0.01），SIRT3表达量降低（P＜0.01），线粒体蛋白乙酰化水平升高（P＜0.01），ATP5A1乙酰化水平升高（P＜0.01），ATP含量降低（P＜0.01），心肌细胞早期凋亡和晚期凋亡均升高（P＜0.01）;与模型组比较，人参皂苷Rg1（200μmol/L）组LDH漏出量降低（P＜0.01），SIRT3表达量升高（P＜0.01），线粒体蛋白乙酰化水平降低（P＜0.01），ATP5A1乙酰化水平降低（P＜0.01），ATP含量升高（P＜0.01），心肌细胞早期凋亡和晚期凋亡均降低（P＜0.05或P＜0.01）;与人参皂苷Rg1（200μmol/L）组比较，人参皂苷Rg1+siSIRT3组LDH漏出量升高（P＜0.01），SIRT3表达量降低（P＜0.01），线粒体蛋白乙酰化水平升高（P＜0.01），ATP5A1乙酰化水平升高（P＜0.01），心肌细胞早期凋亡和晚期凋亡均升高（P＜0.01）;<br>　　乙酰化质谱分析结果表明，人参皂苷Rg1可以去乙酰化ATP5A1,其乙酰化位点可能是ATP5A1氨基酸序列的第2位赖氨酸;SeahorseXFp结果提示，模拟去乙酰化状态的ATP5A1基因过表达质粒组（pATP5A1-R组）基础呼吸、ATP产生、最大呼吸、备用呼吸能力和非线粒体呼吸均升高，质子漏降低，线粒体呼吸功能增强（P＜0.01）。<br>　　研究结论<br>　　1.SSNX通过调控SIRT3降低线粒体蛋白乙酰化水平保护小鼠心肌缺血再灌注损伤。<br>　　2.SSNX可以通过调控SIRT3降低SDHA和ATP5A1乙酰化水平，改善线粒体呼吸功能，减轻HL-1心肌细胞缺氧/复氧损伤。<br>　　3.SSNX的有效物质成分人参皂苷Rg1对缺氧/复氧损伤HL-1心肌细胞存在保护作用，其机制可能是人参皂苷Rg1通过SIRT3介导ATP5A1氨基酸序列的第2位赖氨酸去乙酰化，增强线粒体呼吸功能。