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摘要背景<br>　　食物过敏(Food allergy,FA)是一种由免疫系统对特定蛋白抗原异常反应引起的疾病，不仅严重影响患者的日常生活，还可能危及生命。近年来，FA的发病率逐年上升，尤其在儿童和青少年中更为常见。治疗过敏反应的一线药物是肾上腺素，非一线治疗药物包括H1-抗组胺药、糖皮质激素、口服免疫疗法、微生物治疗等。然而，每种治疗方案存在一定的局限性，因此亟需研究更安全、更高效的治疗方案。<br>　　免疫球蛋白E(Immunoglobulin E,Ig E)介导的FA主要机制是Th2细胞(T helper 2 cells)极化，其特征为Th2细胞在肠黏膜固有层聚集，并分泌促炎细胞因子，导致肠粘膜嗜酸性粒细胞和肥大细胞的扩增，最终促进Ig E抗体的产生。Th2细胞极化可由CD4+T细胞凋亡机制障碍或Th2细胞分化机制异常所致，其具体分子机制有待进一步阐明。<br>　　活化诱导的细胞死亡(Activation-induced cell death，AICD)是维持外周免疫耐受和T细胞免疫稳态的重要机制，其主要的分子机制是Fas信号通路和线粒体凋亡通路介导的细胞凋亡。然而，在过敏性疾病中，CD4+T细胞对AICD呈抵抗状态，进而导致其大量增殖活化，引起严重的过敏反应。然而，在FA中，导致CD4+T细胞发生AICD功能障碍的机制研究尚不足。<br>　　调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)是机体重要的免疫调节细胞，可调控Th2细胞的免疫活性及分化。其中，1型调节性T细胞(Type 1 regulatory T cells,Tr1 cells)作为Treg细胞的一个重要亚群，通过分泌IL-10(Interleukin-10)诱导免疫耐受，与Foxp3+Treg细胞不同，其诱导不依赖于Foxp3(Forkhead box P3)的表达。在FA中，Tr1细胞的免疫抑制功能存在障碍，但其分子机制研究尚不充分。内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ER stress)是错误折叠或未折叠蛋白质的积累所致，可破坏免疫系统的稳态。机体在应对过激的ER stress时，启动未折叠蛋白反应(Unfolded protein response，UPR)。有研究发现，在FA中，皮质醇和ER stress可通过上调Foxp3表达协同抑制Foxp3+Treg细胞的免疫调节功能。然而，ER stress对不依赖Foxp3的Tr1细胞的调控作用及分子机制均尚不完全清楚。<br>　　本课题组前期使用人类全基因组寡核苷酸芯片对FA患者和健康对照志愿者(Health control,HC)的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)进行差异基因表达检测发现，在FA中，Semaphorin 3A(Sema 3A)的表达显著下调。Sema 3A是Semaphorins家族中的重要成员，主要通过与Plexins A1-A4和神经纤毛蛋白-1(Neuropilin-1,Nrp1)形成复合体，发挥免疫调节功能。在过敏性疾病中，Sema 3A表达下调，其蛋白可改善哮喘模型小鼠临床症状并调节Th1/Th2细胞比例，但其具体机制不明确。在FA中，Sema 3A可以通过抑制Pak1的表达和RAS的激活，恢复肥大细胞对凋亡诱导的抵抗。然而，Sema 3A是否可诱导CD4+T细胞和Th2细胞发生AICD尚不清楚。既往研究发现，Sema 3A可通过上调CD4+T细胞中Foxp3的表达，促进Treg细胞分化，而对不依赖Foxp3的Tr1细胞的免疫调节功能的影响及分子机制未见报道。<br>　　为深入研究Sema 3A在FA中对Th2细胞极化的调控机制，我们还通过实验验证Sema 3A的上游调节因素。既往研究发现，姜黄素可以通过抑制Th2细胞分化调节免疫反应。Treg细胞及其细胞因子TGF-β可通过Fas信号通路分别促进树突状细胞及血管内皮母细胞凋亡。所以，我们猜测姜黄素、Treg细胞及TGF-β可能作为Sema 3A的上游调节分子，参与Sema 3A对Th2细胞极化的调节。<br>　　综上所述，本课题主要从三个部分表征在FA中，Sema 3A在Th2细胞极化中的作用机制。第一部分，研究Sema 3A抑制naïve CD4+T细胞向Th2细胞分化的功能及分子机制。第二部分，探索Sema 3A促进CD4+T及Th2细胞发生AICD的作用及分子机制。第三部分，探讨Sema 3A通过调控内质网应激来调节Tr1细胞的免疫抑制功能的作用及分子机制。本研究为Sema 3A调控Th2细胞极化的功能提供有力依据，为FA的潜在治疗靶点和新的研究方向提供了研究基础。<br>　　第一部分Semaphorin 3A抑制Naïve CD4+T细胞向Th2细胞分化的分子机制<br>　　目的<br>　　探讨Seam 3A通过抑制naïve CD4+T细胞向Th2细胞分化，从而抑制Th2细胞极化的分子机制，并进一步验证Sema 3A是否可作为姜黄素的作用靶点。<br>　　方法<br>　　1.用卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)及明矾佐剂对野生型(wild-type，WT)小鼠构建FA模型，用Western Blot及RT-qPCR检测小鼠肠道组织中Sema 3A表达。<br>　　2.构建条件性敲除CD4+T细胞中SEMA 3A基因的小鼠(Conditional knockout,CKO)，用CKO和WT小鼠构建FA模型，用ELISA检测肠道组织及血清中过敏相关免疫指标。<br>　　3.利用磁性细胞分选技术(Magnetic activated cell sorting，MACS)从WT小鼠脾脏中分选naïve CD4+T细胞，用重组IL-4细胞因子诱导Th2细胞分化，并且实验组用外源性重组小鼠Sema 3A蛋白(rSema 3A)干预。用流式细胞术、ELISA、RT-qPCR分别检测Th2细胞比例、Th2及Th1细胞因子表达量;用Western Blot检测IL-4转录因子GATA3及其磷酸化水平;通过分子对接及Co-IP实验验证Sema 3A与GATA3的结合。<br>　　4.从CKO及WT小鼠脾脏中分别分选Sema 3A-/-naïve CD4+T及naïve CD4+T细胞，培养72h。用流式细胞术、ELISA、RT-qPCR分别检测Th2细胞比例、Th2及Th1细胞因子的表达量;用Western Blot检测两组细胞中IL-4的转录因子GATA3及其磷酸化水平。用rSema 3A干预Sema 3A-/-naïve CD4+T细胞，然后用Western Blot及RT-qPCR检测IL-4 的表达量。<br>　　5.用分子对接方法验证姜黄素与Sema 3A的结合。然后，分选naïve CD4+T细胞，实验组用姜黄素干预。用流式细胞术、Western Blot、RT-qPCR及ELISA分别检测Th2细胞比例、naïve CD4+T细胞及Th2细胞中Sema 3A、Th2细胞因子表达量。接下来，将细胞分为四组:姜黄素+Sema 3A-/-naïve CD4+T、姜黄素+naïve CD4+T、Sema 3A-/-naïve CD4+T、naïve CD4+T细胞，用 RT-qPCR检测细胞中IL-4 mRNA表达量。<br>　　结果<br>　　1.FA小鼠血清中OVA-specific IgE,及肠道组织中Th2细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)表达较control组上调，提示建模成功。FA小鼠肠道组织中Sema 3A表达量较control组下调。<br>　　2.与WT+FA组相比，CKO+FA组小鼠腹泻次数、维持时间，及粪便含水量增多，并且肠道组织中Th2细胞因子、及嗜酸性粒细胞过氧化物酶(Eosinophilic peroxidase,EPX)表达上调，血清中OVA-specific IgE、肥大细胞蛋白酶1(Mast cell proteinase 1,Mcpt1)表达上调，而肠道组织中Th1细胞因子(IFN-γ)表达下调。<br>　　3.与naïve CD4+T组相比，rSema 3A+naïve CD4+T组Th2 细胞比例、Th2 细胞因子、GATA3的磷酸化水平均下调，IFN-γ表达上调。分子对接及Co-IP结果提示，GATA3蛋白与Sema 3A蛋白可相互结合。<br>　　4.与naïve CD4+T组相比，Sema 3A-/-naïve CD4+T组Th2 细胞、GATA3 磷酸化水平、Th2细胞因子表达均上调，IFN-γ表达下调。rSema 3A+Sema 3A-/-naïve CD4+T 组 IL-4 表达量较 Sema 3A-/-naïve CD4+T组下调。<br>　　5.分子对接结果提示姜黄素可与Sema 3A结合。与naïve CD4+T相比，姜黄素+naïve CD4+T组Th2细胞比例、Th2细胞因子表达均下调，而naïve CD4+T细胞及Th2细胞中Sema 3A表达上调。姜黄素+Sema 3A-/-naïve CD4+T组IL-4 mRNA表达较姜黄素+naïve CD4+T组上调，同时较Sema 3A-/-naïve CD4+T组下调。<br>　　小结<br>　　1.Sema 3A在FA患者及FA模型小鼠中表达水平下调。<br>　　2.CKO+FA模型小鼠在肠道组织中表现出Th2细胞偏向性炎症。<br>　　3.Sema 3A可通过抑制转录因子GATA3磷酸化，或通过与转录因子GATA 3结合，从而抑制IL-4蛋白合成，进而抑制Th2细胞分化，最终抑制Th2细胞极化。<br>　　4.Sema 3A可作为姜黄素的作用靶点发挥功能。<br>　　第二部分 Semaphorin 3A促进CD4+T细胞及Th2细胞发生活化诱导的细胞死亡的分子机制<br>　　目的<br>　　探讨Sema 3A通过促进CD4+T细胞及Th2细胞发生AICD，从而抑制Th2细胞极化的机制，并进一步探讨Sema 3A是否可作为Treg细胞及其细胞因子TGF-β的作用靶点。<br>　　方法<br>　　1.分选CD4+T、Sema 3A-/-CD4+T细胞，用anti-CD3/28单克隆抗体诱导细胞发生AICD,实验组用rSema 3A干预。用流式细胞术、Western Blot及RT-qPCR分别检测细胞凋亡水平、Fas信号通路及线粒体凋亡通路中明星分子的表达量。<br>　　2.双荧光素酶报告基因实验验证Sema3A对Fas启动子的活性的调节。<br>　　3.分选naïve CD4+T、Sema 3A-/-naïve CD4+T细胞，用 rSema 3A干预Sema 3A-/-naïve CD4+T细胞。用流式细胞术检测Th2细胞中Fas的表达量。<br>　　4.分选CD4+T细胞，用Caspase 8抑制剂Z-IETD-FMK阻断Fas信号通路。用流式细胞术检测CD4+T细胞的凋亡比例。<br>　　5.用Transwell共培养CD4+CD25+Treg细胞与CD4+CD25-Teff细胞。用流式细胞术、Western Blot及RT-qPCR分别检测Teff细胞及Th2细胞中Sema 3A的表达量。<br>　　6.分选CD4+T、Sema 3A-/-CD4+T细胞，用TGF-β1干预细胞。用流式细胞术检测细胞凋亡比例、CD4+T细胞及Th2细胞中Sema 3A及Fas表达量，并用Western Blot及RT-qPCR检测Sema 3A、Fas信号通路及线粒体凋亡信号通路相关蛋白表达。<br>　　结果<br>　　1.与CD4+T组相比，rSema 3A+CD4+T组细胞凋亡比例、Fas信号通路中相关蛋白(Fas、Cleaved-Caspase 3/8)、FAS mRNA水平上调;线粒体凋亡通路相关蛋白Bax表达上调、抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调。与CD4+T组相比，Sema 3A-/-CD4+T组细胞凋亡比例、Fas表达均下调，Bcl-2表达上调。与Sema 3A-/-CD4+T组相比，rSema 3A+Sema 3A-/-CD4+T组细胞凋亡比例、Fas表达上调，Bcl-2表达下调。<br>　　2.双荧光素酶报告基因实验结果提示，转染Sema 3A过表达质粒组Fas启动子活性较转染对照质粒组上调。<br>　　3.与naïve CD4+T组相比，rSema 3A+naïve CD4+T组Th2 细胞中Fas表达水平上调，Sema 3A-/-naïve CD4+T组Th2细胞中Fas表达水平下调。<br>　　4.与CD4+T组相比，Z-IETD-FMK+CD4+T组细胞凋亡比例下调;rSema 3A+Z-IETD-FMK+CD4+T组细胞凋亡比例较rSema 3A+CD4+T组下调，同时较Z-IETD-FMK+CD4+T 组上调。<br>　　5.Treg+Teff组CD4+T细胞、Th2细胞中Sema 3A表达较Teff组上调。<br>　　6.与CD4+T组相比，TGF-β1+CD4+T细胞凋亡比例、Fas信号通路相关蛋白、CD4+T及Th2细胞中Sema 3A及Fas表达均上调，Bcl-2表达下调。TGF-β1+Sema 3A-/-CD4+T组细胞凋亡比例、Fas表达量较Sema 3A-/-CD4+T组上调，较TGF-β1+CD4+T组下调。<br>　　小结<br>　　1.Sema 3A可通过激活Fas信号通路及线粒体凋亡通路，促进CD4+T细胞发生AICD。<br>　　2.Sema 3A可通过激活Fas信号通路，促进Th2细胞发生AICD。<br>　　3.Sema 3A可作为Treg细胞及其细胞因子TGF-β的作用靶点发挥功能。<br>　　第三部分Semaphorin 3A通过调节内质网应激来调节1型调节性T细胞免疫抑制功能的分子机制<br>　　目的<br>　　在FA中，检测Tr1细胞免疫抑制功能水平及其内质网应激水平，并进一步探讨Sema 3A通过调节内质网应激来恢复Tr1细胞的免疫抑制功能的分子机制。<br>　　方法<br>　　1.收集FA患者及HC志愿者的PBMCs，用流式细胞术分选CD4+CD25+LAG3+CD49b+Tr1细胞，用RNA-seq进行测序及生物信息学分析、RT-qPCR、Western Blot分别检测Tr1细胞中内质网应激相关基因、IL-10及其相关基因表达水平，并分析XBP1及IL-10两基因的相关性。<br>　　2.用电穿孔法转染构建IL-10过表达质粒至EL-4细胞，构建表达IL-10的细胞模型(IL10-EL-4细胞)。在IL10-EL-4细胞中过表达XBP1s蛋白后，用RNA-seq测序分析其内质网应激相关基因、IL-10及其相关基因表达水平以及相关性，并用RT-qPCR检测其内质网应激相关基因mRNA表达水平。<br>　　3.用非特异性细胞激活剂PMA(Phorbol myristate acetate)刺激IL10-EL-4细胞，用RT-qPCR检测各组细胞中IL-10 mRNA表达水平。用双荧光素酶报告基因实验验证XBP1s对IL-10启动子活性的调节作用。<br>　　4.用RNAi方法敲低IL10-EL-4细胞中eIF2α的表达(EIF2ARNAi)。用ELISA、Western Blot、ChIP分别检测IL-10蛋白、CMIP蛋白及IL-10启动子部位c-Maf表达量。<br>　　5.用RT-qPCR检测FA患者及HC志愿者Tr1细胞中NRP1及EIF2A mRNA水平，并分析两者的相关性。rSema 3A干预FA患者Tr1细胞(FA.Sema 3A)，用RT-qPCR 检测NRP1及EIF2A mRNA表达量,Western Blot检测eIF2α蛋白水平变化。<br>　　6.流式细胞分别分选FA患者及HC志愿者PBMCs中Tr1细胞及Teff细胞。用CFSE染料对Teff细胞进行染色处理，将经rSema 3A干预或未经rSema 3A干预的Tr1细胞与Teff细胞(比例1∶5)共孵育3天，流式细胞术检测Teff细胞增殖水平。<br>　　7.构建特异性敲除CD4+T细胞中IL-10的IL10f/fCd4-Cre小鼠(CKO)。用WT及CKO小鼠建立FA小鼠模型，从建模第9天开始使用rSema 3A干预。检测小鼠腹泻，核心体温，并用ELISA检测FA相关免疫指标表达量。<br>　　结果<br>　　1.与HC组相比，FA组内质网应激相关分子IRE1、XBP1、ATF6、PERK、GRP78、EIF2A mRNA表达上调，XBP1s蛋白表达上调;IL-10及其相关基因MAF、CMIP mRNA表达下调，并且IL-10与XBP1基因mRNA水平呈负相关性。<br>　　2.与IL10-EL-4组相比，XBP1s过表达组，内质网应激相关基因GRP78、GRP94、PERK和EIF2A表达上调，而IL10、CMIP、MAF和STAT3表达下调，且EIF2A与IL-10、MAF、CMIP、STAT3均有相关性。<br>　　3.与Control.plasmid组相比，XBP1.plasmid组IL-10 mRNA表达水平及IL-10启动子活性均下调。<br>　　4.XBP1sOE组培养液中IL-10表达水平较Control组下调，XBP1sOE.EIF2A RNAi组IL-10表达水平较XBP1sOE组上调，并且CMIP蛋白及IL-10启动子部位c-Maf蛋白表达有上述相同趋势。<br>　　5.与HC组相比，FA组Tr1细胞中NRP1 mRNA表达下调，EIF2A mRNA表达上调，并且两者呈负相关性。与FA组相比，FA.rSema 3A组NRP1 mRNA水平上调，eIF2α蛋白及mRNA水平下调。<br>　　6.与FA组相比，rSema 3A+FA组Teff细胞的增殖能力下调。<br>　　7.与NC组相比，FA组小鼠表现出腹泻、核心温度降低、Serum OVA-sIg E、肠道灌洗液中过敏介质、Th2细胞因子表达上调，提示建模成功。与FA组相比，FA.Sema 3A组小鼠过敏症状减轻，上述免疫指标均下调。与FA.Sema 3A组相比，FA.Sema 3A.CKO组小鼠的过敏症状加重，上述免疫指标均上调。<br>　　小结<br>　　1.FA中，Tr1细胞免疫抑制功能受到抑制并存在过激的内质网应激反应。<br>　　2.FA中，内质网应激相关蛋白XBP1s可通过eIF2α蛋白抑制IL-10的表达水平。<br>　　3.Sema 3A通过上调并结合其受体Nrp1，抑制内质网应激反应，从而上调IL-10表达水平，进而上调Tr1的免疫抑制功能，抑制FA反应。<br>　　全文结论<br>　　在Food allergy中，Sema 3A可通过以下三个机制抑制Th2细胞极化:<br>　　1.Sema 3A可通过抑制转录因子GATA3磷酸化，或通过与转录因子GATA3紧密结合，抑制IL-4蛋白合成，最终抑制Th2细胞分化。<br>　　2.Sema 3A可通过激活Fas信号通路及线粒体凋亡通路，促进CD4+T细胞及Th2细胞发生AICD。<br>　　3.Sema 3A可通过上调并结合其受体Nrp1,抑制内质网应激，从而上调IL-10表达，进而上调Tr1细胞的免疫抑制功能。