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摘要研究背景和目的<br>　　变应性接触性皮炎（ACD）是一种常见的炎症性皮肤病，暴露部位皮肤接触多种变应原后诱发的免疫反应导致了其发生。经过变应原致敏的效应T细胞在激发阶段快速激活并募集到暴露部位，释放促炎细胞因子，招募并激活中性粒细胞在内的其他免疫细胞来诱导炎症级联的放大，最终造成组织损伤。铁死亡与细胞凋亡、焦亡和程序性坏死不同，是一种由铁依赖的脂质过氧化所介导的调节性细胞死亡方式。铁死亡被认为是一种具有免疫原性的死亡方式，能通过释放损伤相关分子模式和警报素来放大细胞死亡效应并促进一系列炎症反应。目前已有许多研究表明铁死亡与一些炎症性皮肤病的发病机制相关。例如相关研究发现铁死亡在银屑病和紫外线诱导的急性皮肤损伤中激活，应用铁死亡特异性抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）则能有效缓解疾病相关表型并减轻炎症效应。然而，在ACD中是否有铁死亡的参与及其作用仍然未知，发生铁死亡的效应细胞仍待解析。<br>　　因此，本研究旨在探索铁死亡是否在ACD中激活及其作用，寻找发生铁死亡的可能靶细胞，同时评估铁死亡特异性抑制剂Fer-1局部外用的干预效应和潜在治疗价值。<br>　　研究方法<br>　　1.选择二硝基氯苯（DNCB）作为半抗原，利用1％DNCB在野生型小鼠背部致敏，并用0.5％DNCB激发小鼠右耳，不含DNCB的基质涂抹小鼠左耳，建立了DNCB诱导的ACD小鼠模型。通过大体表型观测，鼠耳皮炎严重程度评分，鼠耳重量称量，鼠耳厚度测量，鼠耳组织切片H&E染色等方式进行模型评价。<br>　　2.检测鼠耳组织中铁死亡水平:通过蛋白免疫印迹法检测铁死亡关键蛋白GPX4和SLC7A11的蛋白水平，通过实时荧光定量PCR检测铁死亡标志基因mRNA水平。通过原位免疫荧光染色检测脂质过氧化物4-HNE积累水平，并利用C11-BODIPY探针染色后流式上机检测脂质过氧化水平。<br>　　3.通过局部外用铁死亡抑制剂Fer-1干预DNCB诱导的小鼠ACD，观察小鼠皮炎的变化并测量相关指标，评价治疗效果。分析局部外用Fer-1靶向抑制铁死亡的效果，检测铁死亡关键蛋白和关键基因的变化，检测相关脂质过氧化指标。<br>　　4.在小鼠背部皮肤建立ACD模型，通过将DNCB外涂于小鼠腹部致敏并于背部皮肤激发造模，确认ACD中铁死亡激活的具体部位。分离背部真表皮，分析表皮和真皮中铁死亡关键分子水平，免疫荧光检测4-HNE的积累。并通过局部外用Fer-1确认表型干预及铁死亡抑制效应。<br>　　5.繁育角质形成细胞特异性Gpx4条件性敲除小鼠，利用DNCB诱导ACD后观察与同窝对照小鼠的表型差异。<br>　　6.为模拟角质形成细胞在ACD炎症微环境中受到的刺激，利用TNF-α和IFN-γ体外处理培养的HaCaT细胞，并加入铁死亡抑制剂Fer-1评价干预效应。通过GPX4蛋白检测、C11-BODIPY探针染色评价脂质过氧化水平，通过LDH释放实验评价细胞死亡水平。<br>　　7.C11-BODIPY探针染色后通过流式细胞术检测Fer-1干预后激发鼠耳中免疫细胞群的比例及脂质过氧化水平改变。取腹部致敏后背部大面积激发小鼠的引流淋巴结和脾脏，磁珠分选CD45+细胞，体外培养并用Fer-1干预，检测其促炎细胞因子mRNA水平变化。<br>　　8.利用单细胞测序分析外用Fer-1干预后对ACD中不同细胞亚群的影响，通过脂质氧化通路评分评价关键免疫细胞亚群的脂质过氧化水平改变。<br>　　9.相关表面抗体染色及C11-BODIPY探针染色后通过流式细胞术检测Fer-1干预后激发鼠耳中中性粒细胞、巨噬细胞的比例及脂质过氧化水平改变，检测Fer-1干预后激发鼠耳的颈部引流淋巴结中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例及脂质过氧化水平改变。并通过免疫组织化学染色Ly6G、MPO、F4/80、CD4、CD8以进一步确认多种免疫细胞的皮损浸润水平。<br>　　研究结果<br>　　1.通过DNCB在小鼠背部致敏和耳部激发，成功建立了 DNCB诱导的ACD小鼠模型。DNCB激发的鼠耳大体上表现出红斑、水肿，表面干燥伴脱屑和少许糜烂的典型皮炎改变，皮炎严重程度评分增加，鼠耳重量和鼠耳厚度均增加，组织学表型加重。<br>　　2.DNCB诱导的ACD小鼠模型中发生铁死亡的激活，激发鼠耳中铁死亡关键蛋白GPX4和SLC7A11的蛋白水平降低，铁死亡标志基因的mRNA水平发生相应改变，脂质过氧化物4-HNE的积累增加，脂质过氧化水平升高。<br>　　3.外用靶向铁死亡的特异性抑制剂Fer-1能够缓解DNCB诱导的皮炎，改善鼠耳大体表型，降低皮炎评分，减轻鼠耳重量和厚度，缓解组织学变化。同时降低ACD皮损中铁死亡的水平:回复铁死亡关键蛋白水平，回复铁死亡标志基因mRNA水平改变，降低4-HNE积累和脂质过氧化水平。<br>　　4.小鼠腹部致敏，背部激发的小鼠模型中，真皮内铁死亡关键蛋白降低，4-HNE升高。局部外用Fer-1能降低皮肤厚度，抑制真皮内铁死亡关键蛋白和4-HNE水平改变。而表皮内没有发生相应改变。<br>　　5.角质形成细胞特异性Gpx4条件性敲除小鼠经DNCB诱导ACD后，鼠耳的表型和同窝对照小鼠的鼠耳之间没有明显差异。<br>　　6.在经TNF-α和IFN-γ处理以体外模拟ACD炎症微环境的HaCaT细胞中，GPX4蛋白水平没有发生降低。Fer-1的干预没能降低HaCaT细胞在TNF-α和IFN-γ刺激下升高的脂质过氧化水平。Fer-1的干预未能抑制TNF-α和IFN-γ处理诱导的HaCaT细胞的细胞死亡。<br>　　7.DNCB激发后鼠耳中CD45+细胞的脂质过氧化水平升高，而外用Fer-1干预后CD45+细胞的比例下降，脂质过氧化水平受到抑制。在DNCB激发的引流淋巴结和脾脏经磁珠分选的CD45+细胞中，Fer-1干预后Ifn-γ,Il-1β和Cxcll的mRNA水平下降。<br>　　8.单细胞测序结果表明Fer-1干预的DNCB激发鼠耳中中性粒细胞和巨噬细胞亚群的比例减少，T细胞亚群则没有降低。Fer-1处理后中性粒细胞和肥大细胞亚群的脂质氧化通路评分降低，而巨噬细胞、T细胞、树突状细胞和朗格汉斯细胞得分没有明显差异。<br>　　9.Fer-1处理后DNCB激发鼠耳中中性粒细胞的比例下降，组织浸润降低，脂质过氧化水平降低。而巨噬细胞虽然比例减少，组织浸润降低，但脂质过氧化水平没有改变。<br>　　10.尽管Fer-1处理后鼠耳中CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润水平未变，但颈部引流淋巴结在受Fer-1的干预组中，CD8+T细胞的比例升高，脂质过氧化水平下降，而CD4+T细胞没有相应变化。<br>　　结论<br>　　1.在DNCB诱导的ACD小鼠模型中，铁死亡发生了激活，且主要发生在真皮的免疫细胞中。<br>　　2.局部外用Fer-1能够缓解ACD小鼠的皮肤炎症，并且降低铁死亡水平。<br>　　3.ACD免疫微环境中的角质形成细胞没有通过铁死亡的方式参与ACD的发生发展。<br>　　4.在ACD小鼠中，Fer-1的处理可以抑制皮损内中性粒细胞和引流淋巴结中CD8+T细胞的铁死亡。