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摘要背景与目的<br>　　软骨细胞是软骨的主要功能细胞，其活性和功能直接影响软骨的修复与再生。近年来，组织工程技术的不断进步为软骨缺损修复带来了新的思路，其核心在于利用软骨细胞、生物支架和生长因子的协同作用构建功能化组织。作为组织工程的关键种子细胞，软骨细胞的需求量很大，但其来源相对受限，且体外扩增能力受限。与关节软骨细胞相比，鼻中隔软骨细胞因其具有更强的增殖能力、基质合成能力和软骨表型维持能力，在软骨组织工程中展现出显著优势。然而，供体年龄的增长以及体外培养的多次传代和各种刺激，会导致软骨细胞发生衰老。为了保存软骨细胞的功能，高效、稳定的冷冻保存技术成为组织工程临床转化的重要保障。冷冻保存虽能长期储存软骨细胞，但细胞的衰老和冻存过程中的氧化应激可能会影响细胞的存活率和功能恢复。抗坏血酸作为一种强效抗氧化剂，在减轻氧化应激方面具有潜在作用，但其对衰老软骨细胞冻存保护的效果及机制尚不明确。<br>　　本研究旨在探讨细胞衰老对软骨细胞冻存的影响，并评估抗坏血酸在保护软骨细胞活性和功能中的作用，为优化软骨细胞冷冻保存技术、满足组织工程对高质量种子细胞的需求提供理论依据。<br>　　方法<br>　　(1)通过D-半乳糖诱导构建人鼻中隔软骨细胞衰老模型，利用P-半乳糖苷酶染色、CCK-8检测及qRT-PCR验证模型有效性;<br>　　(2)将正常与衰老软骨细胞分别用普通冷冻保护剂和含抗坏血酸的冷冻保护剂进行冻存;<br>　　(3)软骨细胞复苏后通过Calcein-AM/PI染色检测细胞存活率，CCK-8评估细胞活性和增殖能力，DHE染色分析氧化应激水平;<br>　　(4)采用qRT-PCR检测软骨基质相关基因(COL2A1、ACAN、SOX9)、基质降解酶相关基因(MMP13、ADAMTS5)及抗氧化酶基因(SOD1、GPX1)的表达变化。<br>　　结果<br>　　(1)20mg/mL的D-半乳糖能够诱导软骨细胞衰老，显著降低细胞活力、增加β-半乳糖苷酶阳性细胞比例以及显著上调衰老相关基因(p16、p21、p53)的表达;<br>　　(2)冻存后，衰老软骨细胞存活率和活性低于正常软骨细胞，向冷冻保护剂中添加抗坏血酸可以提高衰老软骨细胞的存活率及细胞活力，提高正常软骨细胞的细胞活力，对正常软骨细胞的存活率影响不明显;<br>　　(3)冷冻保护剂中添加抗坏血酸可以改善冻存后细胞的氧化应激状态，减少活性氧的产生;<br>　　(4)冻存会降低软骨的基质合成能力，添加抗坏血酸可减少正常软骨细胞的基质降解，部分恢复衰老软骨细胞的基质合成。<br>　　结论<br>　　软骨细胞的衰老显著降低了细胞冻存后的存活率和功能，抗坏血酸通过减轻氧化应激、促进基质合成基因表达，有效保护衰老软骨细胞，其作用可能与调控抗氧化酶活性和维持细胞稳态有关。本研究为优化软骨细胞冻存策略提供了实验依据。