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摘要背景和目的<br>　　组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶2D(Histone-lysine N-methyltransferase 2D,KMT2D),在小鼠中称为MLL4,是H3K4甲基化复合物的必需亚基，该基因编码的蛋白质是组蛋白甲基转移酶，它能够使组蛋白H3的Lys-4位置甲基化。KMT2D 与 WRAD、NCOA6、PTIP、PA1和H3K27去甲基化酶UTX在一个蛋白质复合物中结合。KMT2D在此复合物中充当支架蛋白，负责维持UTX的稳定性。KMT2D通过促进H3K4的甲基化来调节染色质结构，H3K4甲基化会激活参与发育、分化和代谢的增强子和基因表达。<br>　　调节性T细胞(Treg)是一种主要的免疫负调控细胞，是维持自身免疫耐受和免疫稳态所必需的。根据来源，Tregs可分为两种类型:一种是自然发生的Tregs(nTregs)，它在胸腺中获得免疫抑制活性并迁移至外周;另一种是外周诱导的Tregs(iTregs,也称为pTreg),由外周抗原刺激的CD4+na?ve T细胞诱导。此外，Treg细胞表现出明显的异质性，根据T细胞活化和归巢分子的表达，包括人类的CD45RA或小鼠的CD62L和CD44,可分为静息和活化(rTreg和aTreg)细胞。rTreg(CD62LhiCD441ow)细胞是静止的，主要富集在次级淋巴组织中。aTreg(CD62LlowCD44hi)具有较高水平的抑制功能，主要富集在于非淋巴组织中，寿命较短。有文献报道，从成熟小鼠T细胞中敲除MLL4(KMT2D)时，会损害Treg细胞的发育，上游MLL4结合位点的缺失会降低与MLL4结合部位相连的Foxp3调控元件处H3K4me1,并损害胸腺Treg和诱导型Treg细胞的分化。而目前未对KMT2D对发育成熟的Treg细胞的影响未作研究。因此，本研究采用在Treg细胞中敲除KMT2D的小鼠进行实验，并且通过构建疾病模型，来分析Kmt2d基因对Treg细胞的影响。<br>　　方法<br>　　1.流式细胞术检测正常小鼠免疫器官及非淋巴组织中T细胞亚群:取Foxp3Cre小鼠和Foxp3CreKmt2dfl/fl小鼠的胸腺、脾脏、淋巴结、外周血、肺组织及结肠组织，制备成单细胞悬液，根据实验目的，分别检测CD4+T细胞、CD8+T细胞比例，Treg细胞、rTreg和aTreg细胞比例。<br>　　2.构建小鼠溃疡性结肠炎模型:通过给小鼠连续七天喂2.5％DSS,每天记录体重，观察粪便便血情况。在第七日处死小鼠，解剖取出结直肠段组织，H&E染色观察结肠组织炎症细胞浸润;流式细胞术分析肠系膜淋巴结和结肠黏膜固有层中T细胞亚群变化。<br>　　3.构建小鼠过敏性气道炎症模型:小鼠腹腔注射OVA和A1(OH)3两次，间隔时间为一周，最后腹腔注射再间隔一周后连续两天进行OVA雾化，第三天处死小鼠。冲洗肺泡灌洗液并用流式细胞术检测嗜酸性粒细胞和Treg细胞比例变化;迈格林华-吉姆萨染色检测肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞严重程度。取出肺叶，进行H&E染色观察炎症细胞浸润;Masson染色观察纤维化程度;PAS染色观察黏液分泌程度;流式细胞术分析肺组织中Treg细胞比例和嗜酸性粒细胞比例的变化。流式细胞术检测肺部引流淋巴结Treg细胞比例的变化。流式细胞术检测肺泡灌洗液、肺部引流淋巴结、肺组织、脾脏组织中rTreg和aTreg细胞比例。ELISA检测血清中总IgE和OVA-sIgE。<br>　　4.构建小鼠黑色素瘤模型:小鼠皮下注射1×106个B16/F10黑色素瘤细胞，自注射的第六日起测量肿瘤的长与宽。在第十四天处死小鼠，取下背部完整肿块，进行拍照和测量瘤重，流式检测肿瘤组织中Treg细胞比例。<br>　　5.Western Blot检测KMT2D特异性敲除Treg细胞中甲基化或乙酰化水平变化:通过流式细胞分选仪分选出正常小鼠脾脏组织中Treg细胞，检测Treg细胞中 H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K27ac 的水平变化。<br>　　6.小鼠脾脏Treg细胞的Bulk-RNA组学分析:取出正常小鼠脾脏，制备成单细胞悬液，通过流式细胞分选仪分选出Treg细胞，加入Trizol裂解细胞，进行RNA组学测序，分析差异表达基因以及差异基因的GO富集和KEGG富集分析。<br>　　7.小鼠Treg细胞表面P2X7R的表达:取正常小鼠外周淋巴结和脾脏，通过流式细胞术分析P2X7R+Treg细胞的比例。通过qRT-PCR分析Treg细胞中P2rx7基因的mRNA表达水平。<br>　　8.实时流式细胞术检测Treg细胞对溴化乙锭的摄入:取正常小鼠外周淋巴结制成单细胞悬液，在ATP刺激下，Treg细胞上P2X通道打开允许大分子染料通过，在37°条件下，流式上机检测Treg细胞中溴化乙锭的平均荧光强度的变化，记录总时间为365s，在40s时往细胞悬液中加入ATP刺激。<br>　　9.荧光显微镜检测Treg细胞内Ca2+信号的水平:流式细胞分选仪分选出Treg单细胞悬液，进行Cal-590AM钙离子荧光探针和F-127避光孵育。在ATP刺激下，Treg细胞上P2X通道打开允许钙离子释放，荧光显微镜检测钙离子荧光强度的变化，记录时间为10min，每间隔5s记录拍照，在2min时加入ATP刺激。<br>　　结果<br>　　1.小鼠Treg细胞中KMT2D特异性缺失不影响Treg细胞数量:与Foxp3Cre小鼠对照组相比，Foxp3CreKmt2dfl/f1小鼠的胸腺、脾脏、外周淋巴结和外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞及Treg细胞比例和数量无明显差异（P＞0.05）。肺组织和结肠中Treg细胞比例和数量无明显差异（P＞0.05）。<br>　　2.小鼠Treg细胞中KMT2D特异性缺失降低aTreg细胞产生:与Foxp3Cre小鼠相比，Foxp3CreKmt2dfl/fl小鼠的胸腺、脾脏、淋巴结和外周血中aTreg细胞比例降低（P＜0.05）。而肺组织和结肠中aTreg细胞比例无明显差异（P＞0.05）。<br>　　3.小鼠Treg细胞中KMT2D特异性缺失加重DSS诱导溃疡性结肠炎:相比于对照组Foxp3Cre小鼠，Foxp3CreKmt2fl/fl小鼠体重减轻（P＜0.01）,DAI评分更高（P＜0.001）,结肠长度更短（P＜0.001），H&E染色显示炎症细胞浸润增加（P＜0.001），流式细胞术分析结果显示肠道Treg和aTreg细胞比例降低（P＜0.05），Th17细胞比例增加（P＜0.05）。肠系膜淋巴结中Treg细胞比例无明显差异（P＞0.05）,而aTreg细胞比例降低（P＜0.001）。<br>　　4.小鼠Treg细胞中KMT2D特异性缺失加重过敏性气道炎症:相比于对照组Foxp3Cre小鼠，Foxp3CreKmt2dfl/fl小鼠中:肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞比例（P＜0.001）和数目（P＜0.01）增加，肺组织中嗜酸性粒细胞比例（P＜0.001）和数目（P＜0.05）增加。H&E染色显示肺组织炎症细胞浸润更多（P＜0.05）,Masson染色出现明显的纤维化（P＜0.001），PAS染色黏液分泌更多（P＜0.05）。流式细胞术分析肺组织、肺泡灌洗液和引流淋巴结Treg细胞比例降低（P＜0.05），流式细胞术分析肺组织、引流淋巴结和脾脏中aTreg细胞比例降低（P＜0.05），而肺泡灌洗液中aTreg细胞比例无显著差异（P＞0.05）。ELISA检测血清中总IgE（P＜0.01）和 OVA-sIgE（P＜0.05）的水平增加。<br>　　5.小鼠Treg细胞中KMT2D特异性缺失不影响黑色素瘤的生长:相比于对照组Foxp3Cre小鼠，Foxp3CreKmt2dfl/fl小鼠肿瘤大小、瘤重和肿瘤组织中Treg细胞比例无显著差异。<br>　　6.Western Blot检测小鼠Treg细胞中总体甲基化或乙酰化水平无显著变化:与对照组Foxp3Cre小鼠相比，Foxp3CreKmt2dfl/fl小鼠的Treg细胞中H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K27ac的水平无显著差异。<br>　　7.转录组测序结果显示有298个基因下调，428个基因上调，在这些差异基因中，我们发现P2rx7基因，它在钙内流和与T细胞活化相关的下游信号中起关键作用，在Foxp3CreKmt2dfl/fl组表达显著下调。KEGG通路富集分析，与Foxp3Cre组相比，Foxp3CreKmt2dfl/fl组中钙信号通路表达也下调。<br>　　8.小鼠Treg细胞Kmt2d基因特异性缺失后P2X7R+Treg细胞比例降低:与对照组Foxp3Cre小鼠相比,Foxp3CreKmt2dfl/fl小鼠的P2X7R+Treg细胞比例降低（P＜0.01），并且Treg细胞中P2rx7基因mRNA水平降低（P＜0.01）。<br>　　9.小鼠Treg细胞Kmt2d基因特异性缺失后对溴化乙锭的摄入降低:与对照组Foxp3Cre小鼠相比，Foxp3CreKmt2dfl/fl小鼠的Treg细胞对ATP反应引起的溴化乙锭摄入的平均荧光强度降低（P＜0.01）。<br>　　10.小鼠Treg细胞Kmt2d基因特异性缺失后细胞内钙离子浓度降低:与对照组Foxp3Cre小鼠相比，Foxp3CreKmt2dfl/fl小鼠的Treg细胞对ATP反应引起的钙离子水平变化降低（P＜0.001）。<br>　　结论<br>　　1.小鼠Treg细胞内特异性敲除Kmt2d基因会降低次级淋巴器官中aTreg细胞的比例。<br>　　2.小鼠Treg细胞内特异性敲除Kmt2d基因可显著增加溃疡性结肠炎、过敏性气道炎症模型的炎症反应，而对黑色素瘤的生长无影响。<br>　　3.小鼠Treg细胞内特异性敲除Kmt2d基因会引起下游靶基因P2rx7的表达降低，影响Treg细胞P2X受体对ATP反应引起的溴化乙锭摄入减少和钙离子水平降低。