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摘要背景和目的<br>　　类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以滑膜炎和骨质破坏为特征的免疫性疾病。患者出现关节晨僵、肿胀变形、近端指关节对称性疼痛，运动功能受限等。在成年群体中，RA患病率为0.5％～1％,多发于女性和老年群体，严重影响患者的运动功能，致残率高。RA患者免疫系统失调，CD4+T细胞和巨噬细胞等均参与炎症反应，平衡关节组织稳态和减轻疾病过程中的炎症反应对于RA的治疗至关重要。近年来旋毛虫感染或其虫源分子为自身免疫系统疾病的防治提供了新方向。前期研究发现重组旋毛虫谷胱甘肽-S-转移酶(Trichinella spiralis glutathione-S-transferase,rTsGST)免疫小鼠，可诱导 Th2为主的Th1/Th2混合型免疫反应，rTsGST体外刺激树突状细胞(dendritic cells,DCs)，诱导DCs表面CD40低表达，并抑制LPS诱导的DCs表面CD40、CD80和CD86的表达，亦可降低脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的DCs促炎因子的升高。但是，rTsGST能否减轻缓解RA患者关节炎症反应尚不清楚。因此，本研究构建胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠模型，检测rTsGST免疫后对CIA小鼠足爪病理、体内免疫细胞、细胞因子及足爪骨损伤标志物表达的影响，明确rTsGST对CIA小鼠的治疗作用，为探索rTsGST治疗RA以及其他自身免疫性疾病提供实验依据。<br>　　材料和方法<br>　　1.旋毛虫、实验动物<br>　　ISS534旋毛虫虫株(Trichinella spiralis)分离自河南省南阳市的猪体内，并在本实验室昆明小鼠保种。雄性DBA/1J小鼠(6～8周龄)购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，在SPF条件下进行饲养。本研究涉及的所有动物实验全部符合郑州大学实验动物伦理委员会要求(批准号:NO.SCXK2023-0009)。<br>　　2.rTsGST克隆、表达与鉴定<br>　　用PCR扩增旋毛虫TsGST基因，构建重组克隆质粒pMD18-T/TsGST,进一步构建表达载体pQE-80L/TsGST，通过原核表达获得rTsGST蛋白，并使用Western blot对其进行鉴定。<br>　　3.构建CIA小鼠模型及实验设计<br>　　将24只8～10周龄雄性DBA/1小鼠随机等分为4组，每组6只:PBS组、rTsGST对照组、CIA模型组、CIA+rTsGST治疗组。CIA模型组、CIA+rTsGST治疗组在第0和21天分别给予牛Ⅱ型胶原(bovine type collagen Ⅱ，B CⅡ)乳液进行初次免疫和增强免疫。PBS组和rTsGST对照组在第0、21天时尾根部给予100 μL PBS。rTsGST对照组和CIA+rTsGST治疗组从第24天至第42天，每3天腹腔注射1次rTsGST(1 mg/kg)。PBS组和CIA模型组在相同时间腹腔注射100μLPBS。初次免疫45天处死小鼠并进行各指标的检测。<br>　　4.rTsGST对CIA小鼠的缓解作用<br>　　从第0天开始，每3天测量各组小鼠体重、踝关节厚度、足掌厚度以及关节炎临床评分，评估小鼠足爪的炎症程度。在第7、14、21、28、35、42天时，分离各组小鼠尾静脉血清，ELISA检测各组小鼠在不同时间点体内抗B CⅡ IgG水平的动态变化。在第45天处死小鼠，分析小鼠脾脏指数。<br>　　5.rTsGST对CIA小鼠足爪病理变化的影响<br>　　实验结束当天取各组小鼠的足爪，切片后通过苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)、甲苯胺蓝染色(toluidine blue,TB)评估各组小鼠足爪中的炎细胞浸润情况和软骨损伤情况。<br>　　6.rTsGST对CIA小鼠体内免疫细胞的影响<br>　　实验结束当天收集各组小鼠脾脏细胞，流式细胞术检测脾脏M1、M2型巨噬细胞及Th1和Th2细胞的百分比。取各组小鼠足爪组织切片，免疫荧光检测小鼠足爪M1型巨噬细胞特异性标志分子CD80、M2型巨噬细胞特异性标志分子CD206的表达水平。<br>　　7.rTsGST对CIA小鼠体内巨噬细胞相关炎症因子和表面标志物转录水平的影响<br>　　采用qPCR分别检测小鼠脾脏和足爪组织中巨噬细胞相关因子的mRNA转录水平。分析M1型巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和M2型巨噬细胞标志物精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1)mRNA转录水平，以及其促炎因子(TNF-α、IL-6)、抗炎因子(IL-4、IL-10)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)的 mRNA转录水平。<br>　　8.rTsGST对CIA小鼠足爪骨损伤标志物的影响<br>　　qPCR检测各组小鼠足爪中骨损伤标志物酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)、组织蛋白酶 K(cathepsin K,CTSK)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase 3,MMP3)mRNA转录水平，免疫组化检测小鼠足爪中关节炎病理标志物TNF-α、MMP3和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)的水平。<br>　　9.统计分析<br>　　通过使用GraphPad Prism 9与SPSS软件来完成实验结果的绘图与统计学分析。数据分析采用One-way ANOVA检验方法评估各组之间的差异。当P＜0.05时认为实验结果具有统计学意义。<br>　　结果<br>　　1.rTsGST克隆、表达与鉴定<br>　　以旋毛虫肌幼虫cDNA为模板，对TsGST基因进行扩增，构建pMD18-T/TTsGST克隆载体，再构建pQE-80L/TsGST重组表达质粒。在0.5mMIPTG和37℃条件下诱导pQE-80L/TsGST/Rosetta(DE3)，培养上清经Ni柱纯化后获得rTsGST。<br>　　2.rTsGST对CIA小鼠的缓解作用<br>　　给予rTsGST治疗后，能够改善CIA小鼠体重减轻(F39d=32.91,F42d=48.05,F45d=38.90;P＜0.05);降低CIA小鼠的关节炎评分(F36d=69.97,F39d=89.03,F42d=77.20;P＜0.05);减轻CIA小鼠的足掌肿胀度(F39d=120.16,F45d=75.01;P＜0.05)以及踝关节厚度(F42d=43.69,F45d=34.75;P＜0.05)。<br>　　ELISA结果显示，BCⅡ初次免疫的第14、21、28、35、42天，CIA组和CIA+rTsGST小鼠血清中抗B CⅡ IgG水平明显高于PBS组和rTsGST组(F14d=84.67，F21d=77.53，F28d=1667.97,F35d=308.62,F42d=1143.02;P＜0.001)而在第35、42天时，CIA+rTsGST组小鼠血清中B CⅡ IgG水平较CIA组明显降低(P35d＜0.05,P42d＜0.001)。此外，rTsGST免疫后能够显著降低CIA小鼠的脾指数(F=69.61,P＜0.05)。这些结果表明，rTsGST能够缓解胶原诱导性关节炎小鼠的疾病严重程度。<br>　　3.rTsGST对CIA小鼠足爪病理变化的影响<br>　　HE染色结果显示PBS组和rTsGST对照组小鼠足爪组织结构完整，未见滑膜组织增生、软骨损伤以及炎细胞的浸润，而CIA组小鼠足爪可见大量炎症细胞浸润，滑膜明显增生。经rTsGST治疗后炎症细胞浸润减少(F=127.40,P＜0.01)、骨侵蚀减轻(F=239.48,P＜0.001)及滑膜增生减少(F=137.31,P＜0.01)。TB染色结果显示经rTsGST治疗后减轻了 CIA小鼠软骨的损伤(F=57.18,P＜0.05)。<br>　　4.rTsGST对CIA小鼠体内免疫细胞的影响<br>　　流式细胞术结果显示，CIA小鼠M1(F4/80+CD11b+CD86+)与M2(F4/80+CD11b+CD206+)型巨噬细胞占比均明显升高（FM1=224.83,PM1＜0.001;FM2=25.83,PM2＜0.05)。CIA+rTsGST 组M1与M2型巨噬细胞占比较CIA组均显著降低(PM1＜0.01，PM2＜0.01)。与此同时，CIA组CD4+T细胞中Th1(CD4+IFN-γ+)和 Th2(CD4+IL-4+)细胞占比均明显升高(FTh1=26.8,PTh1＜0.05;FTh2=42.58,PTh2＜0.001)。而 CIA+rTsGST 组小鼠脾脏中 Th1 与Th2细胞占比较CIA组相比显著降低(PTh1＜0.01,PTh2＜0.01)。这些结果表明rTsGST抑制脾脏中巨噬细胞、Th1细胞、Th2细胞的活化。<br>　　小鼠足爪组织免疫荧光试验结果显示，CIA组小鼠滑膜组织M1与M2型巨噬细胞浸润增加(FM1=41.37,PM1＜0.001;FM2=26.80,PM2＜0.001)。而CIA+rTsGST组小鼠滑膜组织M1和M2型巨噬细胞浸润均低于CIA组(PM1＜0.05,PM2＜0.05)。表明rTsGST能够抑制CIA小鼠足爪滑膜组织中巨噬细胞的募集和M1、M2巨噬细胞的活化。<br>　　5.rTsGST对CIA小鼠体内巨噬细胞相关炎症因子和表面标志物转录水平的影响<br>　　qPCR检测小鼠脾脏和滑膜组织中相关因子转录水平。rTsGST能够降低CIA小鼠脾脏中M1型巨噬细胞标志物iNOS和M2型巨噬细胞标志物Arg-1的mRNA 转录水平(FiNOS=48.73,PiNOS＜0.05;FArg-1=63.52,PArg-1＜0.01),降低促炎因子TNF-α、IL-6和抗炎因子IL-4、IL-10的mRNA转录水平（FTNF-α=33.04,PTNF-α＜0.01;FIL-6=12.62,PIL-6＜0.05;FIL-4=34.20,PIL-4＜0.01;FIL-10=177.35,PIL-10＜0.001)。此外rTsGST也降低了 CIA小鼠足爪滑膜组织M1型巨噬细胞标志物iNOS以及M2型巨噬细胞标志物Arg-1的mRNA转录水平(FiNOS=204.31,PiNOS＜0.001;FArg-1=653.27,PArg-1＜0.001),以及促炎因子TNF-α、IL-6和抗炎因子 IL-10 的转录水平（FTNF-α=1235.64,PTNF-α＜0.001;<br>　　FIL-6=359.03,PIL-6＜0.001;FIL-10=993.62,PIL-10＜0.001)。小鼠体内趋化因子MCP-1转录水平的结果显示CIA+rTsGST组脾脏和足爪内MCP-1转录水平均低于CIA组(F脾脏=23.21,P脾脏＜0.05;F足爪=1312.52,P足爪＜0.001)。<br>　　6.rTsGST对CIA小鼠足爪骨损伤标志物的影响<br>　　qPCR检测小鼠足爪骨损伤标志物表达情况的结果显示，rTsGST能够降低CIA 小鼠足爪中 CTSK、MMP3、TRAP 的 mRNA 转录水平（FCTSK=1256.92,PCTSK＜0.001;FMMP3=220.60,PMMP3＜0.001;FTRAP=885.17,PTRAP＜0.05）。免疫组化结果显示，rTsGST能够降低CIA小鼠足爪中TNF-α、MMP3、RANKL蛋白表达水平（FTNF-α=42.87，PTNF-α＜0.01;FMMP3=23.04,PMMP3＜0.01;FRANKL=122.80,PRANKL＜0.001）。<br>　　结论<br>　　1.rTsGST改善了 CIA小鼠的临床症状及病理损伤，对CIA小鼠具有一定的治疗作用。<br>　　2.rTsGST可通过抑制小鼠M1/M2巨噬细胞及Th1/Th2细胞分化，下调趋化因子MCP-1表达，阻断炎症级联反应，减轻骨损伤。