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摘要研究背景<br>　　心肌纤维化是包括心肌梗死(MyocardialInfarction，MI)后心脏不良重塑和进行性功能下降的主要驱动因素。心肌纤维化形成的瘢痕是MI后维持心脏完整结构所必需的，但过量会损害心肌正常舒缩功能，心脏泵血功能下降，以致心力衰竭。MI后心肌纤维化是涉及多信号通路交互的复杂病理过程，既往研究多聚焦于调控TGF-β经典通路干预心肌纤维化进程，但由于TGF-β的组织、疾病特异性和多效性，或对其抑制可能触发其他促纤维化通路的代偿性激活，TGF-β靶向疗法面临诸多副作用与挑战。<br>　　近年的研究关注到IL-11在心肌纤维化中的重要作用。尽管低水平的IL-11mRNA普遍存在，但在健康受试者的血清中很少检测到该蛋白。IL-11通过心脏成纤维细胞的ERK依赖性自分泌信号特异性驱动心肌纤维化，其机制独立于TGF-β等经典通路，且直接调控蛋白分泌而非基因转录。动物模型中，敲除IL-11受体或中和抗体干预可显著抑制MEK/ERK信号通路活化及胶原沉积，抑制纤维化并改善心功能，且该通路是AngⅡ、 TGF-β等多种促纤维化刺激的共同下游节点。<br>　　当前心肌纤维化检测主要依赖组织学染色(如Masson染色)观察胶原沉积，或通过心脏磁共振T1 mapping评估间质纤维化，但其敏感性在早期及弥漫性病变中受限，且无法动态追踪活化成纤维细胞活性。分子生物学技术虽可检测基因、蛋白水平表达特征，却依赖破坏性取样。近年来，靶向成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast Activation Protein, FAP)的 18F-FAPIPET/CT 显像技术因其高特异性与灵敏度受到关注，该技术通过无创示踪FAP表达，可活体识别早期心肌成纤维细胞活化情况并定量评估活动性进展。本研究借助FAPI-PET/CT显像技术，在心肌纤维化大鼠模型中实现了活体、连续性的纤维化活动性评估，其动态可视化特性为深入解析纤维化进程及药物干预效果研究提供了新的方法学视角。<br>　　气虚血瘀证是MI患者的主要证型之一，益气活血法防治IHD取得了良好的临床疗效。本团队基于这一思路研发的益气活血中药双参宁心方(SSNX)可通过调节线粒体质量控制、能量代谢、抑制炎症等多靶点、多通路保护缺血心肌，有效防治心肌缺血再灌注损伤。在研究过程中发现，SSNX有效成分人参皂苷Rg1和脱氢紫堇碱通过Wnt信号通路有效抑制高糖处理的大鼠心肌成纤维细胞的增殖和胶原合成，减少糖尿病冠脉微循环障碍小鼠和小型猪缺血再灌注后心肌纤维化，但其对MI后心衰心肌纤维化的作用及其具体机制尚不明确。本研究通过整合FAPI-PET/CT动态成像技术与体外细胞实验，首次探究SSNX干预MI后心肌纤维化的效应，重点揭示其对IL-11/MEK/ERK信号通路的调控作用。<br>　　研究目的<br>　　1.评估SSNX对心梗后心衰大鼠心功能和心肌纤维化的干预效果;<br>　　2.明确SSNX对心梗后心衰大鼠心肌成纤维细胞激活的时空调控特征;<br>　　3.阐明SSNX通过IL-11/MEK/ERK通路调控心肌成纤维细胞表型转化与功能的作用机制。<br>　　研究方法<br>　　1. SSNX对心梗后心衰大鼠心功能与病理损伤的影响<br>　　以SD雄性大鼠为研究对象，实验分为假手术组(Sham)、模型组(MI)、阳性药沙库巴曲缬沙坦钠组(MI + LCZ696)、SSNX低剂量组(MI + SSNX-L)、SSNX中剂量组(MI + SSNX-M)、SSNX高剂量组(MI + SSNX-H)。通过永久性结扎左冠脉前降支建立心梗后心衰模型，造模成功后连续灌胃给药1周。通过小动物超声心动图评估大鼠心功能;酶联免疫分析( ELISA)法检测血清cTnT、NT-ProBNP和sST-2评估心肌损伤情况;TTC染色测量心肌梗死面积、HE染色观察心肌组织病理改变;ELISA检测血清促纤维化细胞因子TNF-α、IL-1、IL-4、IL-6、IL-13、IL-17A、MCP-1、IL-11 水平。<br>　　2.SSNX对心梗后心衰大鼠心肌成纤维细胞激活和心肌纤维化的影响及蛋白组分析<br>　　以SD雄性大鼠为研究对象，实验分为假手术组(Sham)、模型组(MI)和SSNX中剂量组(MI + SSNX)。造模和给药同前。18F-FAPI PET/CT评估MI后第3、5、7天心肌成纤维细胞活化情况;免疫荧光检测FAP表达水平;Masson染色观察心肌纤维化面积;Western Blot检测心肌组织胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ表达水平;对大鼠左室前壁心肌组织进行DIA定量蛋白组学检测，借助生信分析工具与技术对所获蛋白进行鉴定并筛选组间差异表达蛋白，基于KEGG、GO数据库进行富集分析;对富集到的MAPK信号通路相关蛋白进行定量分析并通过Western Blot进一步检测IL-11/MEK/ERK信号通路蛋白表达水平。<br>　　3.SSNX通过IL-11/MEK/ERK信号通路调控心肌成纤维细胞表型转化与功能活动的机制验证<br>　　以大鼠心肌成纤维细胞为研究对象，实验分为正常对照组( Control)、模型组(TGF-β1)、SSNX组(TGF-β1 + SSNX)、IL-11 敲低组(TGF-β1 + siRNA)、IL-11 过表达组(TGF-β1 + Lenti)、IL-11 过表达+SSNX 组(TGF-β1 + Lenti +SSNX)。除Control组外，其余组均用TGF-β 1处理诱导纤维化。通过CCK8检测心肌成纤维细胞活力，划痕实验检测细胞迁移，EdU实验检测细胞增殖，Western Blot检测α-SMA评估心肌成纤维细胞转分化，Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ评估肌成纤维细胞功能，并检测IL-11、p-MEK、p-ERK等通路蛋白表达水平。<br>　　研究结果<br>　　1.SSNX改善心梗后心衰大鼠心功能，减轻心肌损伤，抑制炎症反应<br>　　与模型组比较，SSNX中、高剂量组可显著升高心梗后心衰大鼠的心脏左室射血分数(EjectionFraction, EF％)、左室缩短分数(Fractional Shortening, FS％),降低左室收缩末期内径( Left Ventricular Internal Diameter at Systole, LVIDs)和左室舒张末期内径(Left Ventricular Internal Diameter at Diastole, LVIDd) (p ＜0.01 )，降低血清心肌损伤标志物cTnT、 NT-ProBNP和sST-2水平（p ＜ 0.01 ),减少梗死面积(p＜0.01或p＜0.05)。HE染色表明，SSNX各剂量组心肌细胞排列紊乱、炎性浸润及纤维断裂等病理特征明显减轻。多因子检测结果发现SSNX中、高剂量组有效逆转MI导致的血清TNF-α、IL-1、IL-4、IL-6、IL-13、IL-17A、MCP-1水平异常升高(p ＜ 0.01或p＜0.05)，但并未在血清中检测到明显IL-11表达。<br>　　2. SSNX减少心梗后心衰大鼠心肌成纤维细胞异常活化与瘢痕形成，并下调IL-11/MEK/ERK通路蛋白表达水平<br>　　Sham组大鼠心脏全程未见FAPI摄取;MI组和MI+SSNX组在MI后第3天出现明显FAPI摄取，且MI + SSNX组SUVmean略高于MI组（p ＜ 0.05）;第3～5天MI组SUVmean快速上升超过MI+SSNX组并持续至第7天(p ＜ 0.01 ）;MI + SSNX组18F-FAPI的摄取从3～5天呈上升趋势，在5～7天时呈下降趋势。MI组的18F-FAPI高摄取区域除了梗死区外，累及更广泛的梗死边缘区，包括LCX供血的6区（基底段前侧壁）、12区（中间段前侧壁），甚至延伸至RCA供血的4区（基底段下壁）和10区（中间段下壁），MI+SSNX组18F-FAPI高摄取区域主要集中于梗死区。免疫荧光结果表明，MI后第7天MI组FAP表达明显增强（p＜0.05），SSNX给药有效逆转其表达上调（p ＜0.05）。Masson染色结果表明MI后第7天左室前壁广泛的纤维瘢痕形成，SSNX给药有效减少了 MI后心肌纤维化面积（p ＜ 0.05）。 Western Blot检测发现SSNX减少MI后心肌组织中的Collagen Ⅰ （p ＜ 0.05）、 Collagen Ⅲ （p ＜ 0.01）沉积。<br>　　基于蛋白质组学分析揭示各组间差异蛋白表达特征。主成分分析（PCA）显示组内样本高度聚集、组间显著分离，差异表达蛋白分析表明: MI组与Sham组共鉴定出3412个DEPs （1561个上调，1851个下调），而SSNX干预后（MI+ SSNX组vsMI组）逆转了 1066个DEPs （610个上调，456个下调）。韦恩图分析发现692个重叠DEPs （占MI组DEPs的20.3％）对SSNX敏感，提示其可能参与药物作用机制。功能富集分析显示，MI诱导的纤维化进程伴随细胞外基质合成通路上调与能量代谢通路（氧化磷酸化、电子传递链）抑制。SSNX干预后，上调蛋白显著关联跨膜质子转运、ATP合酶活性等代谢恢复过程，而下调蛋白集中于胶原沉积与IL-2介导的炎症信号。对交集基因的富集分析进一步表明，SSNX调控的DEPs在线粒体呼吸链组装、脂肪酸β氧化及胶原代谢中富集。KEGG通路分析证实，SSNX通过协同调控代谢稳态（钙信号、氧化磷酸化）与信号转导（MAPK、PI3K-Akt通路）发挥抗纤维化作用，其下调蛋白与血小板激活、黏着斑功能抑制相关。选择MAPK信号通路进行机制验证，首先对MAPK信号通路中相关蛋白进行定量分析，发现MEK/ERK信号通路分支中MEK1、4 MEK2、ERK1和ERK2的表达水平组间差异明显（p＜0.01或p＜0.05）。Western Blot检测进一步表明，MI后IL-11、p-MEK、p-ERK表达水平明显上调（p＜0.05）,MI + SSNX 组 IL-11、p-MEK、p-ERK 表达水平下降（p＜0.05）。<br>　　3.SSNX调控IL-11/MEK/ERK信号通路抑制体外大鼠心肌成纤维细胞增殖、活化与胶原合成<br>　　划痕实验显示，TGF-β1刺激显著增强心肌成纤维细胞迁移能力（p＜0.05）,而SSNX可有效抑制该迁移活性（p＜0.05）。EdU检测进一步表明，TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖(p ＜ 0.01）可被SSNX显著抑制（p ＜ 0.05）。Western blot分析显示，TGF-β1刺激上调α-SMA及胶原Ⅰ/Ⅲ表达（p ＜ 0.01）, IL-11敲低或SSNX干预均能逆转此促纤维化表型（p＜0.01）,而过表达IL-11则加剧纤维化进程（p＜0.01）。进一步机制研究表明，TGF-β 1通过激活IL-11/MEK/ERK通路磷酸化驱动纤维化（p＜0.01），而SSNX可拮抗该通路的异常活化（p＜0.01）。<br>　　研究结论<br>　　1. SSNX可减少MI梗死面积，抑制心肌成纤维细胞异常活化，降低心肌纤维化程度，改善心梗后心功能。<br>　　2. SSNX调控心梗后心肌成纤维细胞活性具有时空特异性特征，MI后第3天促进梗死区成纤维细胞适度激活，5-7天抑制纤维化过度扩展，将活化范围限制在梗死核心区域。<br>　　3. SSNX调控IL-11/MEK/ERK信号通路抑制体外大鼠心肌成纤维细胞活化与胶原合成。