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酪蛋白激酶1α分子胶降解剂在弥漫大B细胞淋巴瘤中作用及机制研究

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摘要非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma, NHL)是一组起源于淋巴系统的恶性肿瘤，发病率和死亡率均居恶性肿瘤前十位，其侵袭性强，致死率高，对人类健康构成严重威胁【1]。弥漫性大B细胞淋巴瘤( Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是NHL中最常见的亚型，约占所有NHL患者的30%-40%。尽管标准化的R-CHOP (利妥昔单抗联合环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松)治疗方案能使一部分患者获得长期生存，但仍有约30%-40%的患者出现复发或耐药[2,3]。因此，为DLBCL患者探索新的治疗方案成为当前亟需解决的关键问题。 　　在过去的数十年中，小分子抑制剂凭借其较高的靶点选择性和可控的药代动力学特性，已成为新型药物开发的核心策略之一。以酪氨酸激酶抑制剂为例，伊马替尼的应用显著提高了慢性髓性白血病患者的十年生存率，使得该疾病从恶性血液肿瘤转变为可长期管理的慢性疾病［4]。然而，小分子抑制剂在临床应用中的局限性逐渐显现。一方面，部分抑制剂由于低选择性导致脱靶效应，从而产生毒副作用；另一方面，靶蛋白的突变或者过表达会导致患者对小分子抑制剂产生耐药；此外，由于许多蛋白质缺乏明确的小分子结合口袋，这使得它们成为“不可成药”靶点，导致传统抑制剂开发面临瓶颈[5-7]。尽管通过结构优化可部分克服上述挑战，但小分子抑制剂的安全性、耐药性及不可成药靶点问题仍是药物研发的关键难题。 　　靶向蛋白降解( Targeted protein degradation, TPD)是一种通过细胞内泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system, UPS)或溶酶体途径特异性诱导致病蛋白降解的新兴治疗策略，其核心优势在于能够通过降解而非抑制靶蛋白，突破传统小分子抑制剂的局限性。TPD在血液肿瘤、实体瘤及神经退行性疾病等领域中展现出广阔前景[8]。蛋白降解靶向嵌合体( Proteolysis targeting chimera,PROTACs)与分子胶降解剂是目前TPD领域的两类核心策略【9】。PROTACs为异双功能分子，其一端靶向目标蛋白，一端招募E3泛素连接酶形成三元复合物，致使目标蛋白被泛素标记，进而被蛋白酶体识别降解。然而，在PROTACs在高浓度下会发生钩状效应，破坏三元复合物的形成并降低疗效［10］。此外，PROTACs因其较大的分子量和复杂的结构，导致低稳定性和低细胞通透性，这是影响其成药性的主要障碍[11，12]。相比之下，分子胶是调节蛋白质-蛋白质相互作用的小分子，其通过促进E3泛素连接酶与目标蛋白之间的相互作用来降解目标蛋白。与PROTACs不同，分子胶降解剂即使在高浓度时也不会产生钩效应。此外，分子胶降解剂分子量更小、细胞通透性更优，但其理性设计难度较高，多依赖表型筛选而非结构导向开发[13，14]。2010年，Cereblon(CRBN)被鉴定为沙利度胺的作用靶点，进一步的研究揭示了此类免疫调节药物(Immunomodulatory drugs,IMiDs)导致CRBN与Ikaros家族锌指转录因子(IKZF1和IKZF3)的结合增加,并促进它们的泛素化降解的分子机制[15,16]。由于IKZF1/3对多发性骨髓瘤细胞的存活至关重要，其降解可显著抑制肿瘤增殖[16]，使得IMiDs在多发性骨髓瘤中得到了广泛的应用，同时也为TPD技术的机制探索与临床应用奠定了基础。 　　靶向蛋白激酶已被证明是一种有效的疾病治疗策略[17]。蛋白激酶和磷酸酶介导的可逆蛋白磷酸化是一种基本的细胞调节机制，其对于细胞周期、细胞生长、分化、代谢和凋亡等关键细胞过程中控制蛋白质活性非常重要[17]。丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员酪蛋白激酶1α(Casein kinase 1 alpha,CK1α)不仅参与细胞周期调控、Wnt/β-连环蛋白以及p53等经典信号通路，还可以通过调控CARD11/BCL10/MALT1(CBM)复合体的稳定性直接激活NF-κB通路，这一特性使其成为抗肿瘤治疗的重要靶标[18-20]。在活化B细胞样弥漫大B细胞淋巴瘤(Activated-B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma,ABC-DLBCL)这一亚型中，核因子 κB(Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB)通路的异常激活已被证实是驱动肿瘤进展的核心机制[21]。现有临床证据显示，虽然布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton tyrosine kinase,BTK)抑制剂通过阻断异常BCR信号通路改善了部分患者预后，但CARD 11等下游基因突变引发的耐药性问题仍亟待解决[22]，这提示靶向CBM复合体上游调控因子CK1α可能为DLBCL治疗开辟新途径。 　　然而，酪蛋白激酶1家族成员间具有高度的激酶结构域序列同源性，导致CK1α特异性抑制剂的开发面临严峻挑战[23]。这一技术瓶颈促使研究者转向TPD领域。来那度胺已被证实可通过CRBN依赖性途径适度诱导CK1α降解，这一特性与其在del(5q)骨髓增生异常综合征中的疗效密切相关[24]。此外，新型双功能分子胶降解剂DEG-35和DEG-77在急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)临床前研究中展现出抗肿瘤活性，通过协同降解Helios(IKZF2)和CK1α延缓人类AML小鼠模型的白血病进展[25]。然而，目前尚未有高选择性的CK1α分子胶降解剂应用于DLBCL,并且靶向CK1α在DLBCL中的作用机制有待深入研究。 　　本研究通过基于分子胶化合物库的表型筛选，成功鉴定出兼具高选择性和高口服生物利用度的CK1α分子胶降解剂INNO-220。在DLBCL细胞及异种移植小鼠模型中，INNO-220均表现出强大的抗肿瘤活性。从作用机制层面分析，INNO-220通过CRBN依赖性途径诱导CK1α蛋白降解，该过程产生双重生物学效应:一方面通过阻碍CBM复合体的组装进而抑制NF-κB信号通路活化，另一方面通过激活p53通路协同发挥抗肿瘤作用。总之，INNO-220不仅为DLBCL患者提供了新型靶向治疗策略，还为患者分层管理提供了科学依据，显著推动了DLBCL的个体化精准诊疗。 　　第一部分:CK1α分子胶降解剂在弥漫大B细胞淋巴瘤中发挥抗肿瘤作用 　　目的: 　　尽管近年来新型免疫疗法和细胞疗法已经显著提高了 DLBCL患者的生存率，但仍有约三分之一的患者因出现耐药或缓解后复发而预后不良，为DLBCL患者寻求新的治疗策略具有重要意义。CK1α通过直接或间接调控促癌信号网络，在多种恶性血液肿瘤的发生发展中起关键作用。目前多种CK1α靶向药物已被开发用于治疗AML等恶性血液肿瘤，并在体外实验体现了良好的活性。本研究旨在探究CK1α分子胶降解剂INNO-220在DLBCL发生发展中的作用，以期为DLBCL患者提供更为精准和有效的治疗方案。 　　材料与方法: 　　1.细胞培养; 　　2. 外周血单个核细胞( Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)的分离; 　　3. CCK8评估细胞增殖; 　　4. 蛋白组学测序; 　　5.蛋白质免疫印迹分析(Western blotting, WB)； 　　6. 构建CRBN基因稳定敲除的细胞株; 　　7. FITC/Annexin Ⅴ染色检测细胞凋亡; 　　8. PI/RNase染色法分析细胞周期; 　　9.统计学分析。 　　结果: 　　1 .首先使用PBMCs细胞进行了细胞活力分析，以评估分子胶降解剂INNO-220的细胞毒性。INNO-220始终展现出良好的安全性，其对细胞活力无明显影响同时显著抑制IL-2分泌。 　　2.为了确定INNO-220对IL-2的抑制是否依赖于CRBN,我们检测了受抗CD3抗体刺激的野生型和CRBN敲除的Jurkat细胞中IL-2的分泌。研究结果证明INNO-220在CRBN敲除的Jurkat细胞中不再发挥其抑制IL-2分泌的作用，表明INNO-220对IL-2的抑制是CRBN依赖的。 　　3.我们接下来使用定量蛋白质组学测序，以确定在INNO-220处理的细胞中的潜在底物。测序结果显示CK1α表现出明显的下调，而p53表现出明显的升高。 　　4.为了进一步验证蛋白质组学测序的结果以及探究INNO-220对CK1α降解作用的机制，我们使用INNO-220处理了野生型和CRBN敲除的细胞系。研究结果证实，INNO-220以剂量依赖的方式降解CK1α,上调p53,而且这两种作用都依赖于CRBN。 　　5.随后，我们检测了 INNO-220在DLBCL中的抗肿瘤潜能。我们首先对12个DLBCL细胞系进行了初步的筛选，包括4个ABC-DLBCL细胞系，8个生发中心B细胞样弥漫大B细胞淋巴瘤(germinal center B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma,GCB-DLBCL)细胞系。该筛选在敏感细胞系中发现了类似的遗传特征，即拥有野生型p53。因此，我们进一步选择了广泛的p53野生型DLBCL细胞系进一步评估细胞活力。研究结果表明，INNO-220剂量依赖性地抑制所有p53野生型DLBCL细胞系的增殖。 　　6.我们接下来探讨了 INNO-220是否能降解DLBCL细胞系中的CK1α。研究结果显示，无论该细胞系是否对治疗有反应，INNO-220在所有检测的DLBCL细胞中都有效诱导了 CK1α的降解。 　　7.考虑到CK1家族成员间高度的激酶结构域序列同源性，我们进一步检测了其在DLBCL细胞中的选择性。INNO-220处理后DLBCL细胞后，我们仅观察到CK1α的有效降解，而不降解其他CK1家族成员，表明INNO-220是一种高选择性的CK1α分子胶降解剂。 　　8.为了探究INNO-220如何抑制DLBCL细胞的活力，我们运用流式细胞术评估细胞凋亡和细胞周期分布。相较于对照组，实验结果显示INNO-220处理后DLBCL细胞呈现了 G0/G1期细胞周期阻滞。此外，INNO-220还可以剂量依赖性地诱导细胞凋亡。同时，我们进行了蛋白免疫印迹分析，发现与流式细胞术数据一致，cleaved-PARP和cleaved-caspase 3,8,9均呈剂量依赖性地增加。 　　结论: 　　1.INNO-220是一种高选择性的CK1α分子胶降解剂。 　　2.INNO-220以CRBN依赖的方式降解CK1α。 　　3.INNO-220诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞，对DLBCL细胞具有显著的抗增殖作用。 　　第二部分:CK1α分子胶降解剂通过调控NF-κB和p53通路抑制DLBCL进展 　　目的: 　　前期数据结果提示新型高选择性CK1α分子胶降解剂INNO-220可以诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞，对DLBCL细胞具有显著的抗增殖作用。靶向NF-κB信号通路的BTK抑制剂已被证明可以改善部分DLBCL患者预后，但CARD11等下游基因突变引发的耐药性问题仍亟待解决。已有研究发现CK1α可以通过调控CBM复合体的稳定性直接激活NF-κB通路，这提示靶向CBM复合体上游调控因子CK1α可能为DLBCL治疗开辟新途径。本研究接下来进一步聚焦于其在DLBCL中的抗肿瘤作用的分子机制，并结合异种移植小鼠模型评估其体内疗效，为开发基于TPD的DLBCL个体化治疗策略提供理论依据。 　　材料与方法: 　　1.细胞培养; 　　2.RNA 测序(RNA sequencing,RNA-seq); 　　3.CCK8评估细胞增殖; 　　4.免疫组化分析(Immunohistochemistry,IHC); 　　5.定量聚合酶链式反应(Quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR); 　　6.蛋白质免疫印迹分析（WB）; 　　7.构建DLBCL异种移植小鼠模型; 　　8.免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP); 　　9.免疫荧光(Immunofluorescence,IF); 　　10.统计学分析。 　　结果: 　　1.为探究INNO-220在DLBCL中发挥抗肿瘤作用的机制，我们通过RNA-seq分析INNO-220处理后的基因表达变化。测序结果发现INNO-220可以上调p53靶基因，而显著抑制NF-κB通路相关基因的表达。 　　2. qPCR实验进一步证实，CDKN1A (P21)、BAX和MDM2等p53靶基因的转录水平在 OCI-Ly3 (ABC-DLBCL)和 OCI-Ly19 (GCB-DLBCL)细胞系中均显著升高,BCL2L1 (Bcl-xl)和TNFA等NF-κB靶基因的抑制仅见于OCI-Ly3细胞。 　　3. 考虑到INNO-220具有激活p53通路和抑制NF-κB通路的双重作用，我们在OCI-Ly3和OCI-Ly19细胞系中系统比较了 INNO-220与BTK抑制剂、MALT1抑制剂和MDM2抑制剂的抗增殖活性。结果显示，INNO-220在OCI-Ly3和OCI-Ly19细胞中的抗增殖活性均优于其他单药。 　　4. 我们还评估了 INNO-220在DLBCL异种移植模型中的体内疗效和安全性。相较于BTK抑制剂和MALT1抑制剂，INNO-220对肿瘤生长具有更好的抑制作用。此外，所有处理组均未观察到体重的显著变化，表明INNO-220 具有良好的体内安全性。 　　5.与体外实验一致，蛋白免疫印迹表明在动物肿瘤组织中CK1α同样被降解，而p53水平显著增加。接下来我们使用免疫组化和免疫荧光继续探究了INNO-220体内抗肿瘤作用的具体机制，结果发现INNO-220给药组Ki-67的表达降低，p53表达升高。而且相较于对照组，INNO-220处理后，p65的核转位几乎完全被抑制。 　　6.我们评估了 INNO-220如何影响p53通路，研究结果发现INNO-220处理后DLBCL细胞中MDMX以及MDM2与p53结合减少，导致p53泛素化减少，从而稳定p53发挥抗肿瘤作用。 　　7. 为了进一步评估INNO-220影响NF-κB通路的作用机制，我们对经INNO-220或MALT1抑制剂处理后的细胞进行了胞核和胞质免疫印迹分析。结果显示在INNO-220处理后细胞质中IκBα水平升高。此外，尽管INNO-220和MALT1抑制剂均表明RelB水平增加，但在INNO-220处理组中，增加的RelB仅定位于细胞质中。 　　8. 为明确在DLBCL中INNO-220抑制NF-κB通路的具体分子调控机制，我们证实了 INNO-220处理后显著抑制了 CBM复合体的组装和激活，导致NF-κB通路抑制。 　　结论: 　　1. INNO-220在表现出有效的p53激活和NF-κB信号抑制的双重作用。 　　2. INNO-220降解CK1α并抑制DLBCL异种移植小鼠模型肿瘤进展。 　　3. INNO-220减少MDMX以及MDM2与p53结合，导致p53泛素化水平下降，从而稳定p53发挥抗肿瘤作用。 　　4. INNO-220破坏CBM复合物的组装和激活，进而抑制NF-κB信号通路。