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摘要研究背景:<br>　　当前HIV流行形式依然严峻，为了能够更加及时、准确描述当前HIV流行情况，需要精确计算HIV发病率。传统的研究发病率的方法是进行前瞻性队列调查和数学模型法，但两种方法皆存在较大的缺陷，难以广泛应用。<br>　　横断面调查结合实验室检测方法，对HIV新发病例进行检测从而评估HIV发病率，可以弥补队列研究和数学模型法的许多缺陷。通过横断面调查，对生物样本进行收集，检测特定的生物标记物。<br>　　检测的生物标志物主要有HIV早期生物标志物，抗体生物标志物等，但上述生物标志物新发感染检测方法仍存在某些缺陷，因此相关研究重点集中于开发新的生物标志物，从而开发更加准确的新发感染检测方法。<br>　　目前最有希望的标志物是HIV准种序列多态性。随着测序技术的不断发展，使用深度测序技术，以HIV准种多样性为标志物，已成为检测HIV新发感染的热门方法。<br>　　研究目的:<br>　　1.初步建立Primer ID三代测序技术、二代测序技术以及SGA技术的新发感染检测方法，进一步比较三种技术方法之间的性能差异。<br>　　2.通过建立稳定扩增HIV pol区2.1kb片段的含Primer ID引物体系，进一步构建Primer ID深度测序技术检测HIV新发感染的完整方法平台，评估该方法的有效性和真实性。<br>　　研究方法:<br>　　1.在反转录过程中使用含有Primer ID的引物，随后进行Pacbio三代测序，在序列分析时，将含有相同Primer ID的序列合并生成一条consensus sequence,最终得到的一系列consensus sequence序列即可代表患者体内原始的HIV-1准种序列。<br>　　2.使用SGA技术、Illumina二代测序技术、Primer ID三代测序技术获得的序列数据进行分析，通过计算基因距离来表现准种多样性，分析基因距离与感染时间之间的线性关系，进行HIV新发感染检测的ROC曲线分析，比较三种测序技术的效能优劣。<br>　　3.确定Primer ID三代测序技术检测新发感染的最佳基因距离统计学指标，之后进行ROC曲线分析，从而评估该方法的真实性，同时对不同亚型的样本分别进行分析，比较不同亚型之间基因距离与感染时间的线性关系与诊断新发感染的真实性是否存在差异。同时利用测序的序列数据进行HIV亚型分析，耐药分析，双重感染分析等，实现数据的多维度产出。<br>　　研究结果:<br>　　1.确定Primer ID扩增引物体积及方法，采用14个随机碱基序列作为Primer ID,并在扩增过程中，对cDNA及一轮PCR产物进行纯化，可实现扩增的阳性率达到85％左右。<br>　　2.研究样本中有130例为CRF_01AE亚型，占比为50％,有56例属于CRF_07BC亚型，占比为18.3％,有53例属于B亚型，占比为26.8％。纵向分析亚型，有4名患者的系列时间点样本的亚型不同，可推测这4名患者发生了双重感染。耐药突变位点检测结果显示，其中PIs主要耐药位点为M46I,比例为2.09％，NRTIs主要耐药位点为S68G,占比为4.60％，NNRTIs主要耐药位点为V106I、V179D,占比分别为12.55％、5.86％。双重感染鉴定70例患者中共有12人发生了双重感染，占比17.2％。<br>　　3.三种测序方法中，Primer ID三代测序技术所得基因距离与感染时间的线性关系最强，且在ROC曲线分析时，曲线下面积最大。因此，相比于二代测序技术以及SGA技术Primer ID三代测序技术检测新发感染的效能更优。<br>　　4.使用Primer ID三代测序技术检测新发感染最佳的统计学指标为基因距离的平均值，线性相关关系分析R2=0.8914,P＜0.0001,ROC曲线分析中，曲线下面积AUC为0.954,P＜0.0001。分亚型分析时，CRF_07BC亚型样本基因距离的均值与感染时间的线性相关关系最强，R2=0.9460,P＜0.0001,但三种亚型ROC曲线下面积无统计学差异。<br>　　研究结论:<br>　　1.本研究建立了可稳定扩增目的片段的Primer ID引物体系及扩增流程，为后续数据分析提供了较稳定的来源保障。证明了 Primer ID三代测序技术相较于SGA技术、Illumina二代测序技术在检测性能方面具有一定的优越性。<br>　　2.确定了通过Primer ID三代测序方法检测HIV新发感染的可行性以及真实性，建立了完整的检测技术平台。证实了该方法在不同亚型中的检测性能无差异。